Дальнобойная петля: Дальнобойная петля, 5 (пять) букв

Здесь лишь напомним ключевые моменты:

1. Берутся две толстые трубки в качестве осей для вибраторов и некоторое количество принимающих элементов – сплошных, из толстой проволоки, или же полых, из тонких трубок. Разницы особой нет: на частотах, где работает цифровое телевидение, ток все равно в основном бежит по поверхности проводника. Вместо толстых трубок для осей можно использовать пластинки фольгированного текстолита.
2. Рассчитывается размер стержней и вибраторов, а также расстояние между ними.
3. Монтируются отдельно левый и правый каналы приема на соответствующих стержнях.
4. Стержни соединяются перемычкой.
5. Подключается коаксиальный кабель.
6. Второй конец фидера уходит к приставке или антенному гнезду цифрового телевизора.

Преимущества:

• Очень широкий диапазон – примерно в 10 раз больше, чем у других ДМВ-устройств.
• По коэффициенту усиления она эквивалентна волновому каналу из 3–4 элементов, но при этом антенна компактнее и технологичнее.
• Универсальность. Годится не только для телевидения, но и для мобильной связи, Wi-Fi и пр. Вопрос лишь в размерах элементов.

Недостатки:

• Сложна в изготовлении. Требуется выдерживать как длину вибраторов, так и расстояние между ними.
• Расчет, в отличие от приведенных выше конструкций, проделать на листке бумаги очень трудно — требуется найти решение примерно полудюжины интегральных уравнений. Поэтому единственный вариант для домашнего мастера – это воспользоваться онлайн-калькулятором в приведенной выше статье.

Народный рейтинг самодельных антенн для цифрового ТВ

Самый честный рейтинг — это тот, который сформирован людьми, уже сделавшими одну или несколько самоделок. У вас есть 2 голоса. Выберите наилучший (+) и наихудший (-) по вашему мнению вариант самодельной антенны:

Волновой канал

17

48

АнтеннаРасчет и сборка антенны «тройной квадрат» для DVB-T2

Читать «Китайская петля» — Антонов Вячеслав — Страница 1

Вячеслав Антонов

Китайская петля

Настоящее есть следствие прошедшего, а потому обращай непрестанно взор свой на зады, чем сбережешь себя от знатных ошибок.

Козьма Прутков

Часть I

Глава первая

Майским днем 1644 года небо над китайским городом Сучжоу было затянуто густым дымом пожарищ. Маньчжурские войска, пришедшие с севера, с заснеженных таежных просторов, пошли на штурм «благословенного» города императорских парков, в котором укрепились отряды Ли Цзычена — проклятого мятежника и погубителя династии Мин. На зубчатых стенах бесновались бритые голодранцы, размахивая топорами, меча из луков, пригибаясь под страшным свистом каленых ядер. Маньчжурские бомбарды, скованные из железных брусьев, укрепленные в широких рубленых колодинах, грохотали, сотрясая землю; и волна за волной — казалось, от горизонта до горизонта — двигались шеренги воинов в пластинчатых железных панцирях. Гудели боевые барабаны, рыжие отсветы пожарищ проскакивали по блестящему металлу, бросая резкие тени на каменные лица. Черным огнем горели узкие глаза, вперившиеся в стену, на которой в крошеве каменных фонтанов, вздымаемых ядрами, летели кровавые ошметья человеческих тел. Шеренги шли одна за одной, неотвратимо и мерно приближаясь к городу. Еще раз ударили пушки, захлопали пищали, с тяжелым грохотом обрушилась стена, затянув полнеба облаком грязно-серой пыли, и тотчас же, приставив лестницы, Маньчжуры густо полезли на стены и хлынули в пролом, сметая оставшихся защитников. Смолкли орудия, из всех звуков остался лишь боевой рев тысяч глоток да сабельный лязг рукопашного боя. Закрутившись на стенах, побоище перевалилось в город, клубки сцепившихся тел заметались среди огненной метели и черного дыма, в которых валились кровли горящих домов. Распахнулись захваченные ворота, и тогда, по команде военачальника северян, в бой пошла маньчжурская конница: слитно гремели копыта, развевались гривы, на бамбуковых древках бились узкие флаги. Сверкая кривыми саблями, конная лава проскочила ворота и покатилась по прямым улицам Сучжоу, рубя бегущих мятежников, оставляя за собой неподвижные тела, втоптанные в темно-красный парковый песок. Ручейки крови, булькая, сбегали к прудам, расходясь грязно-бурыми пятнами в неподвижной воде…

В одном из парков, укрывшись между кустов, за побоищем следил пожилой китаец — невысокий, узкоплечий, сутуловатый. Его загорелая лысина была окружена венчиком седеющих волос. Седыми были свисающие усы и небольшая бородка; узкие глаза, полуприкрытые в странной отрешенности, порой глядели прямо и жестко. Когда резня затихла и всадники северян скрылись за побеленной парковой оградой, китаец показался из своего укрытия и двинулся по дорожке, огибающей пруд. Выйдя из ворот, украшенных шипастыми головами драконов, он оглядел неширокую реку, в которой плясало отраженное пламя горящих барок, круглый разрушенный мост, изрубленные тела в лохмотьях, валяющиеся на берегу. Недалеко крутились всадники, мелькали сабли, слышались крики дорезаемых повстанцев. Из клубов пыли и круговерти лошадиных тел вывалился один конник и, пришпорив крупного гнедого жеребца, тяжело поскакал к китайцу. Чешуйчатые доспехи, составленные из длинных полос, наложенных друг на друга, гремели на скаку. Плечевые и грудные накладки были завернуты, точно крылья жука. С обнаженной сабли летели красные капли крови, со свалявшейся черной бороды — мутные капли пота. Подскакав, всадник круто осадил коня, вскинул саблю, но мгновенно превратил удар в эффектный салют. Храпящий жеребец вскинул тяжелую голову, оплетенную сеткой жил. С железных удил валилась густая пена.

— Ну, здравствуй… как там тебя… — бросил китайцу всадник.

— Ли Ван Вэй, с вашего позволения. Поздравляю с блестящей победой, Ваше превосходительство! — вежливо поклонился китаец.

— Спасибо и тебе… то есть вам, — внимательно глянув в глаза китайцу, поправился Маньчжур. — То место и впрямь оказалось слабым, наши пушки легко проломили стену.

— Полагаю, настала очередь Пекина?

— О да, черт подери! Гавкать вздумали, псы! Всей черни языки повырезаем! — Всадник потряс саблей и, не выдержав возбуждения, поднял коня на дыбы, ударил его пятками и поскакал в ближайшую свалку — рубиться. Китаец же усмехнулся про себя, покачал головой и не торопясь направился вдоль медленной мутной реки от человеческой крови.

На полторы тысячи километров севернее, по летней сибирской степи шел Младший Ученик, спешащий на встречу с китайским Мастером, прибывшим из далекой страны Хань. Мастер собирал учеников в отрогах Кузнецкого Алатау, напоенных запахом тайги и медвяным ароматом альпийских лугов.

Ученик был одет в меховые штаны и куртку, перетянутую кожаным ремнем, на котором висел длинный кинжал из темной бронзы. Еще час назад, на самом раннем, темном рассвете, он проходил мимо санатория, в скудном тополевом парке которого стояли кибитки на массивных деревянных колесах, закрепленных на жердинах-осях тяжелыми кривыми клиньями. У летнего кафе «Ветерок» была вкопана коновязь из вылощенных временем жердей; привязанные к ней, стояли мохнатые кони с луками и круглыми берестяными колчанами, притороченными к войлочным седлам. Рядом остывал горбатый «Запорожец»— кони недовольно фыркали, принюхиваясь к запаху семьдесят шестого бензина. На заднем сиденье, поджав под себя худые ноги, спала девочка в голубых шортах и желтой махровой маечке с изображением морского штурвала.

— Лена, Лена! — хотел позвать Младший Ученик свою сестренку, но не успел — жизни его угрожала опасность, поэтому надо было спешить. Вдоль дороги, выбитой деревянными колесами кибиток и обкатанной мягкими протекторами «Жигулей», росла низкая голубоватая трава. Мелкие степные ястребы сидели на каменных плитах могильников, тут и там разбросанных в предгорной степи. Позади осталось широкое зеркало соленого озера, блестящего под низким рыжим солнцем. За ближайшей грядой раскинулось другое озеро, Собачье (Ит-Куль), с водой холодной и пресной, накатывающей, словно ртуть, на серую береговую гальку. В степи множество озер и все разные, но сейчас Младший Ученик об этом не думал; он торопился, направляясь к ближайшей гряде холмов. На курорте-стойбище остался труп его друга, который тоже шел к Мастеру.

Выйдя к шоссе, он пропустил совхозный «КамАЗ», груженный тюками прессованного сена, — сухие травинки долго кружились в воздухе — и продолжил подъем на холмы. Глухой слитный топот, донесшийся с подножия склона, заставил его обернуться. Со стороны подсобного хозяйства, покачивая пиками, показалась группа всадников в ушастых малахаях. У них были кривые сабли и круглые щиты, притороченные к седлам. Ученик побежал, с трудом переставляя гудящие от усталости ноги. Заметив его, всадники гикнули, ударили пятками мохнатых коней, переводя их в галоп и вытаскивая из-за спины широкие дальнобойные луки. Глухой топот копыт по сухой земле стал яснее, долетели резкие крики погони. Обливаясь потом, Ученик успел доковылять до вершины пологого холма, но кольцо всадников сжималось, загоняя его к обрыву. Обрыв был сложен из выветренных плит слоистого песчаника, под ним крутой травянистый склон, сбегающий к берегу озера. За озером холмы, поросшие невысокими соснами, гряда за грядой. Еще дальше смутно синели горы.

Крики погони стали совсем близкими, они пробивались сквозь шумное дыханье, острой болью разрывающее грудь. Младший Ученик встал на край обрыва, его ступни в мягких кожаных сапогах ощутили ноздреватый камень, влажный от утренней росы. Передний всадник уже крутил над головой камчу — сыромятную нагайку-волкобой. Еще раз оглянувшись, Младший Ученик присел, вытянул руки перед собой, будто нащупывая в воздухе невидимую плоскость, затем, набрав и выдохнув воздух, усилием воли оттолкнулся от камня. Руки и ноги покатились по невидимым плоскостям, от напряжения потемнело в глазах, крупно задрожали кисти. Степной склон откачнулся назад, под ногами мелькнула извилистая речка с берегами в ярко-зеленой осоке, надвинулась озерная вода, покрытая рябью. Сзади вдруг свистнуло, мелькнули деревянные стрелы с узкими гранеными жалами и бронзовыми шариками-свистунками, уходя вниз по крутым дугам. Последняя стрела порвала на плече меховую куртку, крики заглохли, а под ногами уже показались мелкие волны, сквозь которые замелькало каменистое дно. Руки совсем ослабели, а волны уже приблизились, мелькнули спины больших рыб, крупные глыбы на дне, по которым пробегали солнечные змейки. По дну запрыгала и его тень, появившись откуда-то из темно-зеленой глубины; гребень волны коснулся поджатых ног, и, наконец, последним усилием он дотянулся до берега, свалившись на теплую землю, покрытую сухой желтоватой травой.

Зубы для Аллигатора. Чем уникально изделие 305 вертолета Ка-52

Как признают западные военные эксперты этот вертолет «изящен» и «смертельно опасен». А после оснащения Ка-52 новейшей крылатой ракетой, «вертушка» становится практически неуязвимой.

Современный и наиболее универсальный российский разведывательно-ударный вертолет Ка-52 «Аллигатор» вскоре получит возможность применять крылатые ракеты дальностью до 100 километров и это можно считать новым технологическим прорывом.

Сирийская операция подтвердила: Ка-52 — один из самых востребованных и лучших боевых вертолетов в мире. «Аллигатор» способен эффективно вести разведку, уничтожать цели в ближнем бою, выполнять ракетные удары вне зоны действия переносных зенитных ракетных комплексов противника. Россия имеет в боевом строю около 140 таких машин и совершенствование боевых возможностей продолжается.

Предназначенная для Ка-52 новая крылатая ракета известна как «изделие 305», и также успешно прошла боевые испытания в Сирии. Ракета воплощает принцип «выстрелил — забыл». В полете использует инерциальную систему навигации, координаты цели вводятся перед пуском. На финишном отрезке включается головка самонаведения. Она дает возможность ведения защищенной видеотрансляция прямо в кабину вертолета, и пилот если это необходимо может перенацелить ракету. Новая ракета позволяет Ка-52 находиться вне досягаемости ПВО противника и «по-самолетному» конкурировать на поле боя с фронтовыми бомбардировщиками Су-24М и штурмовиками Су-25М.

Один «Аллигатор» способен нести восемь дальнобойных ракет (по четыре на каждом пилоне), предназначенных для уничтожения бронетехники и железобетонных укреплений за горизонтом. Максимальная дальнобойность российских ракет сегодняшней «вертолетной линейки» — 15 километров.

Разведывательно-ударный «король маневра»

Вертолет Ка-52 создан для применения тяжелых систем управляемого и неуправляемого оружия, оснащен современным круглосуточным обзорным комплексом, эффективен в противодействии и регулярным войскам, и террористическим группировкам.

Участие Ка-52 в Сирийской операции ВКС России вызвало значительный резонанс на Западе. По мнению авторов американского издания National Interest, вертолет «изящен» и «смертельно опасен». Портал Business Insider сравнивал «Аллигатора» с американским AH-64 Apache — самой массовой и универсальной машиной своего класса. Заметим, что Apache все же уступает российской машине по вооруженности, защищенности, маневренности, скорости и практической дальности полета, обладая лишь неочевидным преимуществом взаимодействия с беспилотниками.

Вертолет Ка-52 имеет на борту подвижную пушечную установку калибра 30 мм, неуправляемые ракеты калибра 80 и 122 миллиметра, противотанковый ракетный комплекс «Вихрь» (в комплекте 24 сверхзвуковые ракеты, пробивающие даже 900-мм броню). На вооружении состоят также ракеты «Игла» (воздух-воздух), «Атака» (для поражения наземных целей), авиабомбы массой от 100 кг до 500 кг. «Аллигатор» способен нести на борту огромный арсенал — 2,8 тонны боеприпасов, и это мировой рекорд среди ударных вертолетов.

Новейшая система радиоэлектронной защиты и прицеливания позволяет Ка-52 в любое время суток и в любых климатических условиях обнаруживать цели на расстоянии до десяти километров, затем — выстраивать маршрут, предупреждать экипаж об угрозах. Корабельная модификация Ка-52К «Катран» имеет еще более мощное ракетное вооружение и радиолокационное оборудование — дальность обнаружения целей РЛС «Жук-А» до 200 км.

Двухместная бронированная кабина обеспечивает защиту летчиков от бронебойных пуль калибром до 12,7 миллиметров и осколков снарядом калибром до 23 миллиметров. Бронирование и дублирование управления (между двумя членами экипажа) делают Ка-52 самым защищенным вертолетом в мире. Кроме того, «Аллигатор» стал первым серийным боевым вертолетом с системой катапультирования.

Выдающиеся маневренные возможности также помогают «Аллигатору» доминировать, и побеждать в боевой обстановке. Максимальная скорость машины 320 км/час. Ни один вертолет не может так быстро двигаться в любом удобном для него направлении. Ка-52 способен лететь бортом вперед по курсу движения со скоростью до 80 км/час, задним ходом до 100 км/час, и делать «мертвую петлю». Еще одна «фамильная» черта этих «вертушек» — работа на предельно малых высотах. Высокую маневренность обеспечивают два двигателя мощностью по 2400 лошадиных сил.

Путь к успеху

Боевую эффективность и многофункциональность «Аллигатора» специалисты оценили молниеносно. Впрочем, на старте серийного производства Ка-52 приоритетом стали заказы Минобороны РФ (принят на вооружение в декабре 2010 года).

Мировая премьера «Аллигатора» состоялась на выставке Paris Air Show-2013, машина получила восторженные отзывы специалистов. Там Ка-52 впервые продемонстрировал убедительное превосходство над американским АН-64D Apache Longbow и франко-германским Eurocopter Tiger по большинству параметров. И официальный представитель «Рособоронэкспорта» Александр Михеев заявил о готовности поставлять Ка-52 за рубеж «в различной комплектации — ударно-боевой, разведывательный, антитеррористический». Первым покупателем российских «Аллигаторов» стал Египет.

Разведывательно-ударный вертолет Ка-52 «Аллигатор» сегодня представляет собой сплав мощи и торжество высоких технологий, однако к 2022 году будет создан еще более совершенный вертолет Ка-52М. Обновление затронет прицельно-навигационный комплекс, авионику и винтовую группу. Минобороны РФ планирует в 2020 году заключить контракт на поставку 114 модернизированных «Аллигаторов».

Ранее замминистра обороны РФ Алексей Криворучко сообщал о планах ведомства получить до 2027 года более 420 современных вертолетов всех типов, а генеральный конструктор КБ «Камов» Сергей Михеев обозначил экспортный потенциал предприятия — до 15 вертолетов Ка-52 в год.

Винтокрылые Ка-52, «Аллигаторы» и «Катраны», создавались с учетом суровых условий эксплуатации в странах СНГ, Азии и Латинской Америки и имеют серьезный модернизационный задел. У союзников и партнеров России есть возможность значительно укрепить армейскую авиацию национальных вооруженных сил.

Авторские права на данный материал принадлежат сайту «Sputnik Кыргызстан». Цель включения данного материала в дайджест — сбор максимального количества публикаций в СМИ и сообщений компаний по авиационной тематике. Агентство «АвиаПорт» не гарантирует достоверность, точность, полноту и качество данного материала.

петель на основе инсулятора опосредуют распространение h4K27me3 по удаленным микродоменам, репрессируя гены эухроматина | Genome Biology

Дальние контакты энхансера и промотора в контроле экспрессии генов

Во время созревания эритроида Car2 активируется (Welch et al., 2004; Song et al., 2012) параллельно с β-глобин, хотя и на очень низком уровне, в то время как ключевые регуляторы, такие как GATA1 и LMO2, поддерживают аналогичные уровни транскрипции (рис. 1A).ChIP и глубокое секвенирование показали, что LDB1 и члены комплекса GATA1 и TAL1 занимают пару межгенных сайтов, расположенных на -8 и -9 кб выше промотора Car2 и ниже Car3 (неактивного в эритроидных клетках) в клетках костного мозга мыши. (Li et al., 2013), первичные эритроидные клетки мыши (Yu et al., 2009) и MEL-клетки (Soler et al., 2010; Song et al., 2012) (рисунок 1B). Более того, эти сайты отображают заметные энхансерные метки, такие как h4K27ac, h4K4me1 и p300, что делает их сильными кандидатами на регуляторные элементы.

(A) Экспрессия Car2, Lmo2, Gata1 (левая ось) и β-глобина (правая ось) во время дифференцировки клеток MEL с помощью DMSO. Значения в день 1 были установлены на 1. (B) Просмотр в браузере генома для генов Car2 и Car3 с данными о занятости белков и модификациях гистонов для неиндуцированных клеток. Дорожки ChIP-seq взяты из опубликованных данных (Soler et al., 2010; ENCODE Project Consortium, 2014). Сайты LDB1 и Car2 промоторный сайт CTCF выделены оранжевым цветом.(C, D) Анализы временных репортеров в клетках K562 для конструкций, показанных на C, или в клетках MEL для конструкций, показанных на D. Относительная активность люциферазы нанесена на график на (D). Значение для конструкции без энхансера установлено равным 1. (E) Экспрессия Car2 и контрольных генов в клонах с удаленным энхансером. Показаны два гомозиготных клона с делецией. Значение WT было установлено равным 1. (F) Экспрессия генов Car2, Ldb1, Gata1 и Tal1 в обработанных IFN-β клетках E14.5 Ldb1 ^{fl / fl} и без Mx1Cre.Уровень экспрессии в E14.5 Ldb1 ^{fl / fl} без клеток Mx1CRE был установлен на 1. (G) Экспрессия Car2 и контрольных генов в Car2 клонах с удаленным сайтом CTCF. Показаны два гомозиготных клона с делецией. Значение WT было установлено равным 1. См. Также фигуры S1 и S2.

Чтобы спросить, функционируют ли эти сайты LDB1 для усиления транскрипции Car2 , мы сначала провели анализы репортерной люциферазы, в которых последовательности Car2 -8 / -9 или хорошо известный энхансер LCR HS2 локуса β-глобина были клонированы перед промотором SV40 (рис. 1С).В клетках K562, линия эритроидных клеток человека, сайты LDB1 Car2 локуса показали эквивалентную энхансерную активность LCR HS2 по сравнению с вектором только с промотором. В клетках MEL активность области -8 / -9 т.п.н. тестировали с использованием области в 1 т.п.н., охватывающей сайт начала транскрипции Car2 в качестве промотора (рис. 1D). После индукции ДМСО область -8 / -9 увеличивала активность люциферазы примерно в 2-3 раза, что было больше, чем эффект, наблюдаемый с энхансером HS2.

Затем мы удалили последовательности, охватывающие Car2 -8 / -9 сайтов LDB1, используя CRISPR / Cas9-опосредованное редактирование генома в клетках MEL (Cong et al., 2013) (Таблица S1, Рисунок S1). Моно- или биаллельная делеция снижала транскрипцию Car2 в индуцированных клетках MEL дозозависимым образом (рис. 1E). Дополнительная одиночная гРНК более специфично нацелена на связывание комплекса LDB1 на уровне -9 т.п.н. путем удаления сайта GATA1. Транскрипция Car2 была снижена наполовину, что свидетельствует о том, что комплексы, связанные с LDB1 размером -8 и -9 kb, в равной степени способствуют активации Car2 (фигура S2A). Транскрипция других генов, необходимых для дифференцировки эритроидов, таких как Gata1 и Lmo2 , существенно не пострадала, и дифференцировка не изменилась, судя по нормальной индукции мРНК β-глобина (рис. 1E).Вместе эти данные предоставляют убедительные доказательства наличия вышестоящего энхансера LDB1 Car2 , активного в эритроидных клетках, который зависит от LDB1.

Чтобы исследовать роль LDB1 в Car2 экспрессии in vivo , мы использовали модель условной делеции Ldb1 на мышах (Li et al., 2010; Krivega et al., 2014). Cre экспрессия в печени плода E14.5, состоящей в основном из эритроидных клеток, приводит к удалению> 50% Ldb1 (Krivega et al., 2014). В этих условиях экспрессия Ldb1 и Car2 значительно снижается (рис. 1F). Эти данные in vivo и подтверждают идею, что LDB1 важен для активации Car2 во время дифференцировки эритроидов.

В отличие от β-глобина, промотор Car2 занят CTCF, но не комплексом LDB1 (рис. 1B). Чтобы обратиться к функции связывания CTCF в промоторе Car2 , мы использовали CRISPR / Cas9 для удаления промоторных последовательностей, охватывающих два соседних высокоэффективных совпадения с мотивом CTCF (база данных JASPAR (Mathelier et al., 2015) (Таблица S1, Рисунок S1). Удаленная область не была занята факторами, помимо CTCF, для которых данные ChIP-seq доступны от ENCODE для эритробластов и клеток MEL. Транскрипция Car2 подавлялась в индуцированных клетках MEL дозозависимым образом за счет моно- или двуаллельной делеции промоторной области занятости CTCF (рис. 1G), в то время как контрольные гены обычно транскрибировались, что указывает на нормальную дифференцировку эритроидов. Дополнительная одиночная гРНК, разрушающая только два мотива CTCF и 21 п.н. между ними, аналогично сильно снижает транскрипцию Car2 (рисунок S2B).Эти данные показывают, что взаимодействие промотора CTCF является важным компонентом активации транскрипции Car2 .

LDB1-опосредованные энхансеры активируют гены-мишени за счет дальнодействующих взаимодействий (Song et al., 2007; Krivega et al. ., 2014). Чтобы изучить укладку хромосомы в районе Car2 , мы выполнили конформационный захват хроматина (3C) на 40 kb хромосомы 3 мыши с использованием энхансера Car2 -8 / -9 kb в качестве точки обзора (рис. 2A).Обратные праймеры были локализованы в каждом фрагменте, генерируемом частым резаком BstY1, что позволяло рассматривать взаимодействия энхансер-промотор в контексте всех образованных энхансерных контактов. По сравнению с неиндуцированными клетками, дальнодействующие взаимодействия энхансера Car2 были очевидны в индуцированных клетках с пиками, соответствующими сайтам CTCF в промоторе Car2 и первом интроне. Энхансер также контактировал с двумя вышестоящими сайтами CTCF, один из которых находится в теле соседнего гена Car3 (молчащего в эритроидных клетках).Никаких других контактов не наблюдалось для энхансера более 150 т.п.н., окружающего локус Car2 (рисунок S3). Двуаллельная делеция сайта CTCF в промоторе Car2 (рис. 1G) устраняет дальнодействующие взаимодействия, наблюдаемые в индуцированных клетках между энхансером Car2 и геном (рис. 2A).

(A) Частота взаимодействия, определенная 3C между точками Car2 — Car3 с использованием усилителя Car2 в качестве якоря (заштриховано).Сайты рестрикции BstY1 и запрашиваемые фрагменты (поочередно показаны черным или серым цветом) показаны сверху. Фрагмент якоря выделен желтым цветом. КОН, контрольные клетки; ICON, индуцированные контрольные клетки; dCTCF, индуцированный репрезентативный клон с удаленным сайтом CTCF промотора Car2 . *, P <0,05 для сравнения между индуцированными контрольными клетками MEL и индуцированными клетками dCTCF. (B, C) Вестерн-блоттинг иллюстрирует уменьшение белка в репрезентативных стабильных клонах клеток MEL после shRNA против LDB1 (B) или CTCF (C).С, контрольный вектор скремблированной кшРНК. К.Д., нокдаун. Актин служил контролем. (D) Относительная экспрессия Car2 и Gata1 в репрезентативных клонах KD. CON, контрольный вектор скремблированной кшРНК. (E) Частота взаимодействия, определенная 3C между точками Car2 — Car3 с использованием энхансера Car2 в качестве якоря (заштриховано). Детали такие же, как у панели A. CON, control, ICON; индуцированный контроль. К.Д., нокдаун. *, P <0,05 для сравнения между индуцированными контрольными MEL-клетками и индуцированными MEL-клетками LDB1KD и индуцированными MEL-клетками CTCFKD.См. Легенду к рисунку 1B, где показаны источники треков. См. Также рисунок S3.

Затем мы проверили, регулируется ли транскрипция Car2 с помощью LDB1 и CTCF с использованием shRNA-опосредованного восстановления этих белков. В стабильных клонах MEL-клеток с нокдауном LDB1 (KD) многочисленные гены, необходимые для созревания эритроидов, транскрибируются нормально, хотя β-глобин не активируется при индуцировании клеток (Song et al., 2007; Song et al., 2010; Li et al., 2010; Кривега и др., 2014). Клоны со сниженной в 2-3 раза экспрессией LDB1 или CTCF имели значительно более низкие уровни этих белков, чем клетки WT (рис. 2B и C).Экспрессия Car2 была сильно снижена в клонах KD, в то время как в качестве контроля экспрессия Gata1 существенно не пострадала (фигура 2D). LDB1 KD не влиял на транскрипцию CTCF или уровни белка, и наоборот (Рисунок S4). Когда либо LDB1, либо CTCF был снижен, было нарушено образование петель хроматина в индуцированных клетках между -8 / -9 участками энхансера LDB1 и Car2 (рис. 2E). Эти результаты показывают, что активация Car2 связана с образованием петли хроматина между энхансером Car2 , занятым LDB1, и промотором Car2 , занятым CTCF, и что как LDB1, так и CTCF важны для дальнодействующих взаимодействий энхансера Car2 и на Car2 активация.

LDB1 напрямую взаимодействует с CTCF

Проверка данных ENCODE на мышах показывает, что CTCF и его частый партнер cohesin совместно занимают сайт CTCF промотора Car2 . Мы также наблюдали, что KD компонента когезина SMC3 сильно снижает транскрипцию Car2 (не показано). Таким образом, мы рассмотрели, могут ли LDB1 и CTCF / cohesin взаимодействовать, чтобы активировать транскрипцию Car2 . Мы включили коактиваторный комплекс медиатора в анализ, поскольку известно, что когезин взаимодействует с медиатором, образуя петлю энхансера и промоторные области вместе для активации генов в ES-клетках (Kagey et al., 2010).

Мы провели эксперименты по совместной иммунопреципитации с ядерными экстрактами индуцированных и неиндуцированных клеток MEL. Как и ожидалось, основываясь на взаимодействиях cohesin с Mediator и CTCF (Kagey et al., 2010; Xiao et al., 2011), MED1 и фактор загрузки cohesin NIPBL могут иммунопреципитировать CTCF и компонент когезина SMC1 (Figure 3A). Сходным образом антитела к GATA1 иммунопреципитируют CTCF и MED1 (Stumpf et al., 2006; Manavathi et al., 2012) и SMC1, возможно, косвенно (Xiao et al., 2011).В соответствии с GATA1, главным образом функционирующим как часть комплекса LDB1 (Li et al., 2013), антитела LDB1 также иммунопреципитируют CTCF и SMC1, но не MED1.

(A) Co-IP эндогенных белков проводили с использованием экстрактов ядер клеток MEL, обработанных (IMEL) или без (UMEL) ДМСО в течение 4 дней. Антитела к LDB1, GATA-1, MED1 или NIPBL использовали для иммунопреципитации и блотов, разработанных с антителами к CTCF, SMC1 и MED1. Входная полоса содержит 5% иммунопреципитированного материала.(B) Схема протестированных версий CTCF с тегами GST. (C) Гель, окрашенный кумасси синим, иллюстрирующий продукцию белков CTCF, показанных в B, в бактериях (помеченных звездочкой). (D) Вестерн-блот-анализ взаимодействия in vitro между полноразмерными и усеченными формами CTCF и меченным MBP LDB1, разработанным с антителами к метке MBP. (E) Схема HA-тегированных версий LDB1, протестированных на взаимодействие с CTCF. Указаны домены LCCD, OID и LIM LDB1 (см. Текст). (F) Вестерн-блоттинг, разработанный с использованием антител либо к метке V5, либо к CTCF входящего материала, и иммунопреципитированному (IP) материалу полноразмерными или усеченными формами HA-меченного LDB1.Успешное продуцирование каждого из белков в клетках 293T показано ниже в блоте, разработанном с использованием антител к метке HA. См. Также рисунок S4.

Интересно, что иммунопреципитация LDB1-CTCF сильно обогащена индуцированными клетками MEL. Уровни CTCF и LDB1 не изменяются при индукции клеток MEL (Song et al., 2007) (рисунок S4). Разница может отражать посттрансляционную модификацию CTCF и / или ассоциацию дополнительных белков, которые могут способствовать взаимодействию в индуцированных клетках или противодействовать взаимодействию в неиндуцированных клетках.В целом, результаты указывают на то, что CTCF может быть важным для образования энхансерных петель в эритроидных клетках и повышает вероятность того, что комплекс LDB1 определяет участвующие энхансеры.

Для дальнейшего изучения потенциального взаимодействия CTCF и LDB1 мы провели анализа in vitro GST pull-down с использованием E. coli , экспрессирующего полноразмерный GST-tagged CTCF и делеционные конструкции, включая N-концевой, цинковый палец или С-концевые домены (рис. 3Б, В). На рисунке 3D показано, что LDB1 взаимодействует с полноразмерным CTCF и с доменом цинковых пальцев CTCF, общим модулем взаимодействия для CTCF.LDB1 не взаимодействует с CTCF C-концевой областью LDB1 и только слабо взаимодействует с N-концевым доменом.

Используя аналогичный подход, N-концевые HA-меченые делеционные мутанты LDB1 (фиг. 3E) экспрессировали вместе с V5-меченным CTCF в клетках 293T. Минимальная область LDB1, необходимая для взаимодействия с CTCF, содержала LDB1 / Chip-консервативный домен (LCCD) и NLS (van Meyel et al., 2003), а также другой взаимодействующий домен (OID), через который взаимодействует Drosophila Chip. с инсуляторным белком Su (Hw) (Torigoi et al., 2000) (Рисунок 3F). Поскольку GATA1 не экспрессируется в клетках 293T, мы заключаем, что он не является необходимым для взаимодействия между CTCF и LDB1. Эти результаты подтверждают идею о том, что LDB1 и CTCF взаимодействуют через определенный домен в каждом белке

Модуль взаимодействия LDB1 с CTCF необходим и достаточен для активации Car2

Чтобы проверить важность домена LDB1 LCCD для взаимодействия с CTCF, мы провели из-за потери и получения функциональных исследований. Во-первых, мы использовали CRISPR-Cas9 для нацеливания на LDB1 путем делеции экзона 9 в клетках MEL (рис. 4A, B).Были получены стабильные клоны, в которых LDB1 не определялся вестерн-блоттингом, а белок Car2 , как и ожидалось, был значительно снижен (фиг. 4C). Car2 Экспрессия не определялась в клетках LDB1 KO, эктопически экспрессирующих контрольный вектор EGFP, но восстанавливалась после экспрессии HA-меченного LDB1 (фиг. 4D). Однако меченый HA LDB1, у которого отсутствует домен LCCD, не смог спасти экспрессию Car2 выше уровней, наблюдаемых при ложной трансфекции, что подтверждает необходимость LCCD для дальнодействующей функции энхансера Car2 .

(A) Модель гена для Ldb1 с экзоном 9, выделенным красным. (B) ПЦР-проверка делеции 9-го экзона Ldb1 с использованием фланкирующих праймеров. Показаны типичные WT и клоны с моно- или двуаллельной делецией. (C) Показан вестерн-блот клеточных экстрактов репрезентативных WT и клонов с моно- или двуаллельным удалением. Блоты были разработаны с использованием антител к LDB1 или CAR2, а актин служил контролем. (D) RT-qPCR с РНК, экстрагированной из клеток LDB1 KO MEL, эктопически экспрессирующих полноразмерные HA-LDB1, HA-LDB1ΔLCCD, HA-LMO-DD или HA-LMO-DD-LCCD или EGFP в качестве контроля.Планки погрешностей указывают на SEM; n = 3 биологических повтора.

Клетки LDB1 KD также неспособны экспрессировать β-глобин, но транскрипция может быть восстановлена ​​за счет эктопической экспрессии полноразмерного LDB1 (Krivega et al., 2014). Транскрипция β-глобина также может быть восстановлена ​​в клетках KD путем экспрессии слияния домена димеризации LDB1 с LMO2 (LMO-DD), что указывает на необходимость и достаточность DD для восстановления β-глобина (Krivega et al., 2014) . LMO-DD не может спасти экспрессию Car2 в клетках LDB1 KO (рис. 4D).Однако включение LCCD в слитый белок (LMO-DD-LCCD) привело к значительному снижению экспрессии Car2 . Эти эксперименты с потерей и усилением функции устанавливают роль LDB1 LCCD в активации Car2 на больших расстояниях. Поскольку все спасательные конструкции содержали LDB1 DD, мы не можем исключить прямой или косвенный вклад DD в спасение Car2 . В целом, мы пришли к выводу, что взаимодействие LDB1-CTCF обеспечивает неожиданный механизм для рекрутирования CTCF в функцию петлевания энхансера, специфичную для эритроидного клона.

Энхансеры, связанные с LDB1, соединяются петлей с генами, которые заняты CTCF

Далее мы рассмотрели, может ли пример регуляции дальнего действия Car2 комплексом LDB1 и CTCF иметь более общее значение для образования петли энхансера и его функции в эритроидных клетках. Примечательно, что репрессор гамма-глобина Bcl11a плода (Xu et al., 2010) входит в петлю и активируется интронными энхансерами, занятыми LDB1, но промотор Bcl11a занят CTCF, а не LDB1, как и Car2 ( Bauer et al., 2013; Консорциум проектов ENCODE, 2014 г.). Сходным образом ген Myb не имеет сайтов занятости LDB1, но несколько предполагаемых энхансеров, занятых LDB1, по-видимому, замыкаются на промотор / первый интрон, который содержит сайт CTCF (Stadhouders et al., 2012).

Чтобы получить более полное представление о репертуаре эритроидных энхансеров в масштабе всего генома, мы использовали данные ENCODE ChIP-seq от неиндуцированных клеток MEL и алгоритм ChromHMM (Ernst et al., 2011) для построения набора скрытых марковских моделей (https: // doi .org / 10.5281 / zenodo.439534 и см. Дополнительные материалы). Мы определили модель с 6 состояниями, в которой h4K4me1 и h4K27ac (энхансерные метки), h4K4me3 и h4K36me3 (активные генные метки), h4K27me3 (репрессированный хроматин) и DNase-seq (регуляторные области) в качестве модели с наиболее легко интерпретируемыми биологическими состояниями ( Рисунок S5A и дополнительные методы). Модель выявила 48 041 энхансер в эритроидных клетках, из которых 7 765 (16%) были заняты LDB1 (рис. S5B). Это, вероятно, представляет собой подмножество энхансеров, занятых комплексом LDB1, поскольку, когда мы использовали данные GATA1 Chip-seq в качестве прокси для занятости комплекса LDB1, 53% энхансеров были оценены как положительные (не показаны).

Чтобы получить точную полногеномную идентификацию генов, связанных с этими предсказанными энхансерами, мы пересекли эти данные с результатами Hi-C захвата промотора эритроидных клеток, что является мощным средством определения соответствующих функциональных пар энхансер-ген (Schoenfelder et al., 2015 ). Мы обнаружили, что 84% названных нами энхансеров связаны по крайней мере с одним геном, и 88% энхансеров, занятых LDB1, были задействованы таким образом (рисунок S5B), обеспечивая функциональную проверку названных энхансеров. Таким образом, в целом энхансеры в эритроидных клетках прочно связаны с генами посредством дальнодействующих взаимодействий.

Рисунок 5A иллюстрирует наше предсказание модели ChromHMM известного энхансера +23 kb Runx1 (Nottingham et al., 2007). Комплекс LDB1 занимает энхансер и промотор гена, аналогично конфигурации в β-глобиновом локусе (Song et al., 2007), и между ними происходит дальнодействующее взаимодействие (Schoenfelder et al., 2015). Также наблюдались дальнодействующие взаимодействия между предполагаемыми энхансерами, занятыми LDB1, и генами, не занятыми LDB1 (рис. 5B, C). Например, гены Cpeb4 Plcl2 взаимодействуют с так называемыми удаленными сайтами энхансеров, занятыми LDB1. Cpeb4 и Plcl2 сами по себе не заняты LDB1, но имеют сайты CTCF либо в промоторе ( Plcl2 , аналогично Car2 ), либо в первом интроне ( Cpeb4 , аналогично Myb ).

(A) Просмотр в браузере генома локуса Runx1 . Показаны положения состояний ChromHMM с цветовой кодировкой, как на рисунке S5A. Модель гена взята из RefSeq, а сигналы — из данных, используемых в моделях, плюс дополнительные треки для GATA1, TAL1 и P300.Обсуждаемые в тексте области энхансера и CTCF выделены оранжевым цветом (pro — промотор; int — интрон; enh — энхансер). (B) Просмотр в браузере генома Plcl2 и (C) Cpeb4 . Для каждого вида отображается занятость LDB1 и CTCF. Петлевые взаимодействия Capture-C, описанные Schoenfelder et al. (Schoenfelder et al., 2015), показаны изогнутыми черными стрелками. Enh, предполагаемый усилитель; int, интрон; профи, промоутер. (D) Графики показывают экспрессию генов для репрезентативных клонов после моно- или двуаллельной делеции CRISPR / Cas9 указанного предполагаемого энхансера по сравнению с клетками WT.Показаны два гомозиготных клона с делецией. (E) Частота взаимодействия, определяемая 3C между местоположениями в локусе Cpeb4 с использованием предсказанного энхансера в качестве якоря (заштриховано). Сайты рестрикции Eco RI обозначены желтыми треугольниками внизу. Cpeb4 ΔEnhancer, репрезентативный клон с удаленным энхансером Cpeb4 . Дорожки LDB1 и CTCF на панелях A-C взяты из опубликованных источников (Soler et al., 2010; ENCODE Project Consortium, 2014). На панелях D и E планки погрешностей указывают на SEM; n = 3 биологических повтора.* = p <0,05, ** = p <0,01 и *** = p <0,001 по критерию Стьюдента по сравнению с неиндуцированными клетками MEL WT. См. Также рисунок S5.

Чтобы спросить, являются ли сайты, занятые LDB1, в контакте с этими генами, настоящими энхансерами , мы использовали подход редактирования генома CRISPR / Cas9 (Таблица S1). Биаллельная делеция предполагаемых межгенных энхансеров, занятых LDB1, которые зацикливаются на Cpeb4 или Plcl2 , снижает экспрессию в 3-4 раза, но не устраняет ее полностью (фиг. 5D).В обоих этих локусах дополнительные потенциальные энхансеры, занятые LDB1, участвуют в петлевых взаимодействиях с генами, вероятно, обеспечивая дополнительные регуляторные влияния, что согласуется с наблюдениями по всему геному нескольких энхансеров, взаимодействующих с отдельными генами (Sanyal et al., 2012; Jin et al. , 2013; Schoenfelder et al., 2015).

Захват конформации хромосомы (3C) подтвердил идентификацию захвата Hi-C петель между Cpeb4 и предполагаемыми LDB1-занятыми вышестоящими энхансерами (рис. 5C, E).Удаление одного из этих энхансеров привело к значительной потере взаимодействия с сайтом CTCF в интроне 1, что согласуется с уменьшением транскрипции (рис. 5E). Кроме того, shRNA-опосредованное снижение CTCF или KO LDB1 также снижает дальнодействующие взаимодействия Cepb4 с энхансером. Эти исследования делеций и нокаутов подтверждают идею, что взаимодействие LDB1-CTCF лежит в основе образования петель и активности энхансеров в выбранных локусах в эритроидных клетках.

Эритроидные гены преимущественно задействованы связанными с LDB1 энхансерами в эритроидных клетках

В наборе генов, запрашиваемых на предмет дальнодействующих взаимодействий (Schoenfelder et al., 2015), мы сравнили составленный из литературы набор из 775 эритроидных генов (http://doi.org/10.5281/zenodo.189503 и см. Дополнительные материалы) с оставшимся набором аннотированных генов (24 806, здесь после «других» генов ) и классифицировали гены на подмножества в зависимости от контакта с энхансером. Эритроидные гены были обогащены для взаимодействий по крайней мере с одним энхансером (p = 4,1e-66; отношение шансов 6,8, точный критерий Фишера) и для взаимодействий с энхансером, связанным с LDB1 (p = 1,6e-78; отношение шансов 4,3, точный критерий Фишера. ) по сравнению с другими генами (Рисунок S5C).

Почти все (94%) эритроидные гены связаны с энхансером, и из них 582 (80%) петлей связаны с энхансером, связанным с LDB1, что подтверждает идею о том, что энхансеры, связанные с LDB1, являются преобладающими активаторами генов эритроидов (Fujiwara et al., 2009; Yu et al., 2009; Kassouf et al., 2010; Soler et al., 2010; Li et al., 2013; Mylona et al., 2013) (рисунок S5C). Однако из энхансеров, связанных с LDB1, которые зацикливаются на гене, только 24% были зациклены на эритроидном гене (рисунок S5B), а остальные связывались с другими генами, что позволяет предположить, что энхансеры LDB1 выполняют более широкие функции в эритроидных клетках, чем считалось ранее. .Мы отмечаем, что набор эритроидных генов не является исчерпывающим, и вероятно, что эритроидные гены присутствуют в наборе «других» генов.

Альтернативно, «другие» гены могут иметь общие компоненты энхансерных механизмов, которые мы предлагаем здесь для эритроидных генов.

Эритроидные гены были экспрессированы на значительно более высоких уровнях, чем другие гены (рисунок S5C) (9,3 против 1,8 среднего TPM, p = 5,4e-47, U-критерий Манна-Уитни). Гены эритроидных петель также связаны с несколькими энхансерами, связанными с LDB1, значительно чаще, чем другие гены (2.6 против 1,0 средних энхансеров на ген, p = 7,0e-88, U-критерий Манна-Уитни) (рисунок S5D). Например, высокосвязанный ген эритроида, Epor , взаимодействует с семью связанными с LDB1 энхансерами, некоторые из которых находятся на расстоянии более 150 т.п.н. (Рисунок S5E). Количество энхансеров на ген эритроида еще больше увеличивалось, когда GATA1 использовался в качестве заместителя для определения занятости комплекса LDB1 (не показано). Взятые вместе, эти результаты показывают, что в эритроидных клетках с генами эритроидов предпочтительно связываются энхансеры по сравнению с другими генами, и что среди этих контактов энхансеры, занятые LDB1, сильно обогащены.

Связь на большом расстоянии с генами эритроида с помощью энхансеров, занятых LDB1

Интересно, что и LDB1, и CTCF связаны с многопетлевым промотором EpoR (рисунок S5E). Этот результат поднимает вопрос об участии, как по отдельности, так и вместе, взаимодействий LDB1-CTCF, описанных здесь, и о ранее описанной димеризации LDB1 (Krivega et al., 2014) в ландшафте контактов с эритроидным энхансером.

На фиг. 6A (и см. Фиг. S5C) сравнивается занятость LDB1 и CTCF в эритроидных генах и «других» генах, которые были зациклены на по крайней мере одном связанном с LDB1 энхансере в эритроидных клетках.Из 582 эритроидных генов, которые контактировали с энхансером, связанным с LDB1, 84 (14%) имели LDB1, но не CTCF на своем промоторе (аналогично β-глобину), а 210 (36%) имели CTCF, но не LDB1 (аналогично Car2). ) , на их промоторе и 178 (31%) были заняты обоими белками (аналогично EpoR) . Промоторы с одним LDB1 или с LDB1 и CTCF сильно обогащены среди эритроидных генов по сравнению с другими генами (отношение шансов = 3,2, p = 1,3e-16, точный критерий Фишера; отношение шансов = 3,8, p = 2,9e-37, точное значение Фишера). test соответственно).Напротив, CTCF без LDB1 обычно появляется на промоторах как эритроидных генов, так и других генов (отношение шансов = 0,91, p = 0,31, точный критерий Фишера).

(A) Гены делятся на две группы: эритроидные гены и другие гены. Для каждой группы нанесен процент генов, промоторы которых заняты LDB1, CTCF, обоими белками или ни одним из них. Каждая группа рассматривается как единое целое (все), а группа, экспрессия которой снижается при нокдауне LDB1 KD и восстанавливается за счет экспрессии полноразмерного LDB1 в клетках MEL, рассматривается отдельно (KD / спасенная).(B) Модели, изображающие дальнодействующее взаимодействие между энхансером, связанным с LDB1, и геном, занимаемым CTCF или LDB1, для активации экспрессии.

Сравнение с анализом RNA-seq показало, что 46 эритроидных генов, связанных петлей с энхансером, занятым LDB1, восстанавливаются при LDB1 KD и восстанавливаются за счет экспрессии полноразмерного LDB1 (Krivega et al., 2014). В этой репрессированной и спасенной группе было 198 «других» генов, что по понятным причинам больше, поскольку большинство энхансеров, связанных с LDB1, связаны с неэритроидными генами (рисунок S5C).Промоторы эритроидных генов с петлей LDB1-энхансера были заняты одним LDB1 (11 генов, 24%), одним CTCF (15 генов, 33%) или обоими (18 генов, 39%). Только 2 (4%) промотора гена эритроида не содержали ни одного белка, в отличие от 65 «других» генов (33%). Это предполагает, что «другие» гены используют другие белки для контакта с энхансерами, занятыми LDB1, чем гены эритроидов. Мы пришли к выводу, что эритроидные гены с высокой вероятностью регулируются энхансерами, занятыми LDB1 посредством образования петель, опосредованной димеризацией LDB1 (Krivega et al., 2014) или за счет образования петель, опосредованных взаимодействием LDB1 / CTCF либо по отдельности, либо вместе (Рисунок 6B).

ОБСУЖДЕНИЕ

Транскрипционный комплекс LDB1 является первичным медиатором активации глобального эритроидного гена (Fujiwara et al., 2009; Yu et al., 2009; Kassouf et al., 2010; Soler et al., 2010; Li et al. ., 2013; Mylona et al., 2013). В наиболее изученном примере, локусе β-глобина, комплекс занимает как энхансер LCR, так и ген β-глобина. Зацикливание между этими элементами, от которого зависит активация транскрипции, опосредуется димеризацией LDB1 (Deng et al., 2014; Deng et al., 2012; Кривега и др., 2014). Здесь мы идентифицируем многочисленные LDB1-связанные энхансеры, которые взаимодействуют с эритроидными генами, занятыми CTCF, но не LDB1, и показываем для избранных генов, что прямое взаимодействие между LDB1 и CTCF лежит в основе этих контактов. Таким образом, LDB1 может кооптировать CTCF во взаимодействиях энхансеров, специфичных для определенного типа клеток, чтобы вносить вклад в транскриптом эритроида. Этот результат обеспечивает механистическое объяснение того, как энхансеры, занятые LDB1, могут активировать гены, такие как Myb и Bcl11a , которые не заняты LDB1, но имеют сайты промотора или первого интрона CTCF.

Недавние данные описали различия в ландшафте энхансеров между нейральными клетками-предшественниками и эритроидными клетками фетальной печени или изменения, наблюдаемые в ландшафте по мере дифференциации эритроидных клеток-предшественников (Schoenfelder et al., 2015; Huang et al., 2016). Здесь мы сосредоточились на молекулярных механизмах, используемых энхансерами, которые определяют транскриптом зрелого эритроида. Большинство (80%) эритроидных генов, которые связаны по крайней мере с одной петлей энхансера с энхансером, связанным с LDB1, что указывает на преобладание LDB1-опосредованной активации энхансера этих генов (Li et al., 2013). Из эритроидных генов, которые связаны с этими связанными с LDB1 энхансерами и регулируются LDB1, что определяется снижением экспрессии LDB1 KD и восстановлением при повторной экспрессии LDB1 (Krivega et al., 2014), наибольшая доля (39%) была заняты как LDB1, так и CTCF на их промоторах. Связывающие мотивы LDB1 и CTCF почти всегда (73%) были разделены более чем на 100 п.н., что позволяет предположить, что петли двух типов различаются по своим якорям генов, но могут функционировать вместе (данные не показаны). Мы предполагаем, что петли энхансер / ген, опосредованные более чем одним механизмом, обеспечивают стабильность, а также гибкость взаимодействий, влияющих на экспрессию целевого гена.

Дополнительные 33% этих эритроидных, чувствительных к LDB1 / спасенных генов были заняты CTCF, но не LDB1, что поднимает вопрос, может ли петлеобразование этих генов с энхансерами, занятыми LDB1, быть независимым от димеризации LDB1. Однако транскрипция репрезентативных генов этого типа не может быть восстановлена ​​путем экспрессии мутантов с дефицитом димеризации LDB1 (Krivega et al., 2014) в клетках LDB1 KD (Рисунок S6). Интересно, что все эти гены зациклены на множественных энхансерах, занятых LDB1.Мы предполагаем, что димеризация LDB1 может вносить вклад в общую архитектурную организацию, необходимую для активации транскрипции в этих локусах, посредством объединения нескольких энхансеров вместе. Создание петли энхансер-энхансер может быть даже более сильным компонентом этой организации, чем образование петель энхансер-гена (Zhu et al., 2016; Stevens et al., 2017)

Мы также заметили, что 198 генов из «другого» набора не определены как erythroid связаны с LDB1-связанными энхансерами и, вероятно, регулируются LDB1, что определяется снижением экспрессии LDB1 KD и восстановлением при повторной экспрессии LDB1.Хотя это число, вероятно, будет завышенным из-за неполного списка эритроидных генов, мы предполагаем, что энхансеры, связанные с LDB1, имеют функции, выходящие за рамки функций, связанных с эритроидными генами. Действительно, недавние сообщения описывают участие LDB1 в регуляции дальнодействующих генов в избранных неэритроидных клетках (Caputo et al., 2015; Zhang et al., 2015; Costello et al., 2015). Хотя молекулярные детали еще предстоит проработать, в этих случаях только LIM или LIM-гомеодоменные белки и факторы связывания ДНК, отличные от таковых в эритроидных клетках, вероятно, опосредуют взаимодействие LDB1 с ДНК.Напр., В кардиальных клетках-предшественниках LDB1 может функционировать вместе с ISL1, чтобы регулировать специфические для сердца гены на больших расстояниях (Caputo et al., 2015). Потенциальная способность LDB1 взаимодействовать с большим семейством тканеспецифичных только LIM и гомеодоменных белков LIM и через них с различными транскрипционными факторами и кофакторами, предполагает, что LDB1 является очень универсальным фактором образования петель энхансера.

Энхансеры, занимаемые комплексами LDB1, часто совпадают с генетическими вариантами, связанными с SNP, согласно исследованиям полногеномных ассоциаций (GWAS) (Maurano et al., 2012; Су и др., 2013). Среди этих ассоциаций есть многочисленные случаи, когда энхансер LDB1, содержащий SNP, взаимодействует с геном, релевантным фенотипу SNP, промотор которого занят CTCF, но не LDB1 (Maurano et al., 2012). В частности, в пределах Myb и Bcl11a энхансеров, SNPs группируются в сайтах связывания комплекса Ldb1 (Bauer et al., 2013; Stadhouders et al., 2014). В целом известно, что SNP группируются в петлевых регуляторных сайтах генов в масштабе всего генома (Rao et al., 2014). Таким образом, понимание белковых игроков в образовании петель энхансеров дальнего действия может предложить мишени, относящиеся к множеству генетических заболеваний.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОЦЕДУРА

Культура клеток

Клетки эритроидного лейкоза (MEL) и клетки эмбриональной почки человека (293T) культивировали в среде DMEM, а клетки эритролейкемии человека K562 культивировали в RPMI 1640 с 10% фетальной гумидифицированной сывороткой крупного рогатого скота. при 5% CO2. Дифференцировку клеток MEL индуцировали при концентрации 2.5 × 10 ⁵ клеток на мл с 1,5% ДМСО в течение 4 дней.

Индуцибельная делеция гена Ldb1 в первичных клетках

Индуцибельная делеция Ldb1 в первичных эритроидных клетках мышей из эмбрионов E14.5 была выполнена, как описано (Krivega et al., 2014).

Reporter Assay

Использовали систему Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) и люминометр AutoLumat LB LB 953 (Berthold). 1,57 т.п.н. фрагмента ДНК Car2 -8 / -9 или β-глобина LCR HS2 сливали с промотором SV40 или промотором Car2 мыши и клонировали в pGL4.2 светлячок Люцифераза вектор. Люцифераза Renilla (pGL4.74) служила внутренним контролем. Трансфекцию в клетки K562 и MEL проводили с использованием реагента Lipofectamine LTX Plus, как рекомендовано производителем (Invitrogen).

Коиммунопреципитация (Co-IP)

Co-IP эндогенных белков выполнялась с использованием ядерных экстрактов клеток MEL, обработанных с помощью или без DMSO в течение 4 дней, как описано (Song et al., 2007). Для эктопически экспрессируемых белков клетки 293T трансфицировали CTCF-V5 или HA-LDB1.Клетки лизировали в IP-буфере 1 (25 мМ HEPES pH 8,0, 500 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ NaF, 1 мМ NaVO4, 0,1% Tween 20 и ингибиторы протеаз). Очищенный лизат разбавляли IP-буфером 2 (25 мМ HEPES pH 8,0, 2 мМ EDTA, 1 мМ NaF, 1 мМ NaVO4, 0,1% Tween 20 и ингибиторы протеаз) до конечной концентрации 150 мМ NaCl. Клетки, экспрессирующие мутанты с делецией LDB1, предварительно обрабатывали MG132 в течение 6 часов для ингибирования протеасомной деградации. Очищенные экстракты инкубировали с агарозой против НА (Sigma) в течение 2 часов при 4 ° C.Гранулы промывали буфером, содержащим 25 мМ HEPES pH 8,0, 200 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ NaVO4, 0,1% Твин 20 и ингибиторы протеаз. Связанные белки элюировали глицином. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE, и иммуноблоты получали с помощью системы обнаружения ECL Plus (Fisher Scientific). Относительно антител см. Таблицу S2.

Pull down анализ

GST-слитые белки CTCF и MBP-LDB1 были экспрессированы в E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) и очищены с использованием гранул глутатион-сефарозы (GE Healthcare Inc.) и амилозную смолу (New England Biolabs) в соответствии с инструкциями производителя. Элюированные белки анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против МВР (см. Таблицу S1).

Продукция и трансдукция вируса

HA-меченных белков были сконструированы с вектором pLenti6 / V5-D-TOPO (Invitrogen). Лентивирусные shРНК LDB1 (клоны TRCN0000039019 и -31920) и CTCF (клоны TRCN0000096339 и -96340) были приобретены у Open Biosystems. Клетки 293FT трансдуцировали векторами и упаковочной смесью Virapower (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что высокоскоростное центрифугирование выполняли на подушке из 20% сахарозы.Для получения стабильных клонов и пулов клетки MEL инкубировали с вирусными частицами в присутствии 6 мкг / мл полибрена и отбирали с 5 мкг пуромицина или 40 мкг бластицидина в течение до 2 недель.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

ChIP выполняли, как описано (Song et al., 2007). Различия в обогащении ДНК определяли с помощью кПЦР в реальном времени с использованием химии SYBR с ABI 7900HT (Applied Biosystems). Показаны результаты из 3 независимых повторов, а полосы ошибок указывают на SEM.Относительно антител см. Таблицу S2. Для праймеров ChIP см. Таблицу S3.

Анализ конформации хроматина (3C)

3C выполняли, как описано (Tolhuis et al., 2002; Song et al., 2007; Hagege et al., 2007), за исключением того, что сшитый формальдегидом хроматин дважды расщеплялся BstYI. или EcoRI на ночь. Эффективность пищеварения контролировали, как описано (Hagege et al., 2007). Бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), содержащие локусы CAR (RP23-330N22 и RP24-385I21) или Cpeb4 (BMQ-72D14) и ERCC3 (RP24-97P16), расщепляли BstYI или EcoRI и повторно лигировали для мониторинга эффективности ПЦР (контрольный шаблон).КПЦР в реальном времени выполняли на приборе ABI 7900HT с использованием зондов Taqman и праймеров (таблица S4). Значения были нормализованы к ERCC3 (Palstra et al., 2003) и к 2 невзаимодействующим фрагментам за пределами Car2 / Car3 . Показаны результаты из 3 независимых повторов, а полосы ошибок указывают на SEM.

Реакция обратной транскрипции

РНК, обработанная ДНКазой I (1 мкг), подвергали обратной транскрипции с использованием Superscript III в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). кДНК разводили до 200 мкл, и 2 мкл кДНК амплифицировали в реакционном объеме 10 мкл или 25 мкл с помощью кПЦР в реальном времени с использованием химии SYBR.Праймеры см. В Таблице S3. Показаны результаты, по крайней мере, для 3 различных препаратов РНК, и данные были нормализованы к Gapdh. Планки погрешностей на рисунках соответствуют SEM.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали в буфере RIPA (50 мМ трис-HCl при pH 8, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS) и концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка BCA. (Thermo Scientific). Образцы разделяли гелем NuPAGE, переносили на PVDF-мембраны в соответствии с инструкциями производителя и зондировали антителами, перечисленными в таблице S1.Блоты были разработаны ECL Plus (Thermo Scientific).

Редактирование гена с использованием CRISPR / Cas9

MEL-клетки трансфицировали липофектамином LTX plus (Invitrogen) или нуклеофактором (Lonza) в соответствии с предложениями производителей. Вектор экспрессии Cas9 (pCas9_GFP, # 44720, подарок К. Мусунуру) и векторы экспрессии направляющей РНК (пгДНК) были получены от Addgene. Целевые последовательности показаны в таблице S4. Через 48 часов после трансфекции верхние 0,1% положительных по EGFP клеток были отсортированы с помощью FACS ARIA II (BD biosciences), и отдельные клоны выращивались в 96-луночных планшетах.Геномную ДНК очищали с помощью набора для крови и тканей DNeasy (Qiagen), а генотипирование выполняли с помощью полимеразы Q5 taq (NEB) и целевых специфичных праймеров, фланкирующих делеции (рисунок S1). Делеции были подтверждены секвенированием (таблица S1).

Вычислительные методы, сбор и подготовка данных

Подробнее см. Дополнительные материалы и методы.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Industrial IoT Wireless 4-20mA Current Loop Receiver

Безопасность Интернета вещей

Мы очень серьезно относимся к безопасности Интернета вещей, поэтому мы шифруем каждый датчик, шлюз, модем и устройство Интернета вещей в линейке продуктов NCD Enterprise.Шифрованием управлять намного проще, чем вы могли ожидать, поскольку шифрование не мешает использованию устройства. Мы включаем стандартный 128-битный ключ шифрования AES в каждое устройство или можем помочь вам интегрировать новый ключ шифрования во все ваши устройства. Все аппаратные устройства должны использовать один и тот же ключ шифрования. После того, как ключи установлены, остальное оборудование сделает за вас на 100% в фоновом режиме.

Беспроводной диапазон и протокол

NCD Беспроводные IoT-датчики большого радиуса действия используют протокол DigiMesh® от Digi.com. DigiMesh® был разработан ПРОМЫШЛЕННЫМ лидером в области безопасной беспроводной связи для промышленных приложений. DigiMesh® автоматически перескакивает данные от шлюза к шлюзу, пока они не прибудут в желаемое место назначения. Датчики NCD IoT могут обеспечивать связь на расстоянии 2 мили по прямой с включенными антеннами и до 28 миль при использовании антенн с высоким коэффициентом усиления.

Данные вашего датчика Интернета вещей принадлежат вам!

Ваши данные принадлежат ВАМ, и вам решать, куда вы хотите получить данные своего датчика IoT.Не увлекайтесь ограничениями проприетарных облачных решений, размещайте данные там, где они вам нужны больше всего. Мы предлагаем открытый протокол связи, чтобы вы могли интегрировать беспроводные передатчики NCD в свое собственное программное обеспечение. Это позволяет интегрировать датчики NCD IoT в любую систему управления или шлюз, какой вы только можете себе представить. Отправляйте данные на ПК, Mac или Linux или Raspberry Pi с помощью модемов NCD. Отправляйте данные на популярные облачные платформы, такие как Microsoft® Azure® IoT, Losant и MQTT, с помощью микрошлюзов NCD.Мы также можем помочь получить данные от беспроводных датчиков Интернета вещей NCD на встроенные платформы, такие как Arduino. Мы также предлагаем образцы кода для Microsoft® Visual Studio, Node-RED, LabVIEW® и Python. Наша документация полностью раскрывает структуру пакетов, поэтому возможна интеграция с другими языками. Возможно, мы даже сможем помочь, поэтому, пожалуйста, свяжитесь с нами, если вы работаете с платформой, не упомянутой здесь.

Диапазоны и прогрессии | Kotlin

Kotlin позволяет легко создавать диапазоны значений с помощью функции rangeTo () из kotlin.диапазоны и его операторская форма .. . Обычно rangeTo () дополняется в или ! В функциях.

if (i in 1..4) {// эквивалент 1 <= i && i <= 4 печать (я) }

Диапазоны интегрального типа ( IntRange , LongRange , CharRange ) имеют дополнительную особенность: их можно перебирать. Эти диапазоны также являются прогрессиями соответствующих интегральных типов.

Такие диапазоны обычно используются для итерации в для циклов.

fun main () { // sampleStart for (i in 1..4) print (i) // sampleEnd }

Чтобы перебирать числа в обратном порядке, используйте функцию downTo вместо .. .

fun main () { // sampleStart for (i in 4 down To 1) print (i) // sampleEnd }

Также можно перебирать числа с произвольным шагом (не обязательно с 1). Это делается с помощью функции step .

fun main () { // sampleStart для (я в 1..8 шаг 2) печать (i) println () for (i in 8 down To 1 step 2) print (i) // sampleEnd }

Чтобы перебрать диапазон чисел, который не включает его конечный элемент, используйте функцию от до :

fun main () { // sampleStart for (i in 1 до 10) {// i in [1, 10), 10 исключено печать (я) } // sampleEnd }

Диапазон

Диапазон определяет закрытый интервал в математическом смысле: он определяется двумя его значениями конечной точки, которые оба включены в диапазон.Диапазоны определены для сопоставимых типов: имея порядок, вы можете определить, находится ли произвольный экземпляр в диапазоне между двумя заданными экземплярами.

Основная операция для диапазонов: содержит , которое обычно используется в форме в операторах и ! В операторах .

Чтобы создать диапазон для вашего класса, вызовите функцию rangeTo () для начального значения диапазона и укажите конечное значение в качестве аргумента. rangeTo () часто вызывается в форме оператора .. .

версия класса (val major: Int, val minor: Int): Comparable { override fun compareTo (other: Version): Int { if (this.major! = other.major) { вернуть this.major — other.major } вернуть this.minor — other.minor } } fun main () { // sampleStart val versionRange = Версия (1, 11) .. Версия (1, 30) println (Версия (0, 9) в versionRange) println (Версия (1, 20) в versionRange) // sampleEnd }

Progression

Как показано в приведенных выше примерах, диапазоны целочисленных типов, такие как Int , Long и Char , можно рассматривать как их арифметические прогрессии.В Kotlin эти прогрессии определяются специальными типами: IntProgression , LongProgression и CharProgression .

Прогрессии имеют три основных свойства: первый элемент , последний элемент и ненулевой шаг . Первый элемент — это , первый , последующие элементы — это предыдущий элемент плюс шаг . Итерация по прогрессии с положительным шагом эквивалентна проиндексированному циклу для в Java / JavaScript.

для (int i = first; i <= last; i + = step) { // ... }

Когда вы создаете прогрессию неявно путем итерации диапазона, элементы этой прогрессии первые и последние являются конечными точками диапазона, а шаг равен 1.

fun main () { // sampleStart for (i in 1..10) print (i) // sampleEnd }

Чтобы определить пользовательский шаг прогрессии, используйте функцию шаг для диапазона.

fun main () { // sampleStart для (я в 1..8 шаг 2) печать (i) // sampleEnd }

последний элемент прогрессии вычисляется следующим образом:

• Для положительного шага: максимальное значение, не превышающее конечное значение, такое, что (последний - первый)% шаг == 0 .

• Для отрицательного шага: минимальное значение не меньше конечного значения, такое, что (последний - первый)% шаг == 0 .

Таким образом, последний элемент не всегда совпадает с указанным конечным значением.

fun main () { // sampleStart for (i in 1..9 step 3) print (i) // последний элемент равен 7 // sampleEnd }

Чтобы создать последовательность для итерации в обратном порядке, используйте вниз до вместо .. при определении диапазона для него.

fun main () { // sampleStart for (i in 4 down To 1) print (i) // sampleEnd }

Progressions реализуют Iterable , где N равно Int , Long или Char соответственно, поэтому вы можете использовать их в различных функциях сбора, таких как карта , фильтр и другие. .

fun main () { // sampleStart println ((1..10) .filter {it% 2 == 0}) // sampleEnd }

Последнее изменение: 22 марта 2021 г.

Считыватель дальнего действия | Пакстон

Использование с Switch3 или Net2

Встроенный интерфейс громкой связи

Максимальный диапазон считывания 5 м с жетонами громкой связи

Яркий светодиодный дисплей виден даже при солнечном свете

Прочный корпус

Легкий монтаж

About — Считыватель дальнего действия был разработан специально для точек доступа на автостоянку.Его дальность считывания до 5 метров означает, что жетон громкой связи можно считывать изнутри автомобиля. Встроенный интерфейс громкой связи избавляет от необходимости прокладывать контуры заземления. Считыватель дальнего действия подходит для автомобилей разных размеров. На каждую точку доступа необходимо установить только один считыватель. Считыватель дальнего действия также работает как считыватель с близкого расстояния, так что пользователи без жетонов громкой связи могут его использовать.

Установка — Закрепите монтажную пластину на стойке. Кабели питания и данных проходят через монтажную пластину и в заднюю часть считывателя через два сжимающих сальника.Считыватель подключен, как показано на этикетке блока управления. Кроме того, считыватель подключен к источнику питания. Считыватели должны быть установлены так, чтобы их активные поля не перекрывались.