M mati: Mati M Walnut Поднос от Zanat. Онлайн каталог. Galerie 46

Пентус Мати Рейнович — пользователь, сотрудник

Пентус Мати Рейнович — пользователь, сотрудник | ИСТИНА – Интеллектуальная Система Тематического Исследования НАукометрических данных

Пентус Мати Рейнович пользователь

МГУ имени М.В. Ломоносова, Механико-математический факультет, Отделение математики, Кафедра математической логики и теории алгоритмов, профессор, с 15 ноября 1995

доктор физико-математических наук с 2001 года

доцент по кафедре математической логики и теории алгоритмов с 16 февраля 2000 г.

Соавторы: Пентус А.Е., Беклемишев Л.Д., Семёнов А.Л., Новиков С.П., Успенский В.А., Адян С.И., Андреев Н.Н., Гончаров С.С., Лысёнок И.Г., Матиясевич Ю.В., Осипов Ю.С., Плунгян В.А., Рахилина Е.В. показать полностью…, Садовничий В.А., Татевосов С.Г., Тихомиров В.М., Шень А.

32 статьи, 3 книги, 5 докладов на конференциях, 1 тезисы доклада, 8 НИР, 1 стажировка, 1 членство в редколлегии журнала, 2 членства в программных комитетах, 3 диссертации, 9 дипломных работ, 1 курсовая работа, 25 учебных курсов

Количество цитирований статей в журналах по данным Web of Science: 58, Scopus: 176

РИНЦ:

IstinaResearcherID (IRID): 1545603

ResearcherID: K-2779-2018

Scopus Author ID: 16414824700

ORCID: 0000-0002-9483-7594

Деятельность

Статьи в журналах
- - 2019 Владимир Андреевич Успенский (27.11.1930–27.06.2018)
  - Адян С.И., Андреев Н.Н., Беклемишев Л.Д., Гончаров С.С., Ершов Ю.Л., Матиясевич Ю.В., Осипов Ю.С., Пентус М.Р., Плунгян В.А., Рахилина Е.В., Садовничий В.А., Семёнов А.Л., Татевосов С.Г., Тихомиров В.М., Шень А.Х.
  - в журнале Успехи математических наук, издательство Наука (М.), том 74, № 4(448), с. 165-180
- - 2006 Sergei Ivanovich Adian (on his 75th birthday)
  - Beklemishev L.D., Lysenok I.G., Mal’tsev A.A., Novikov S.P., Pentus M.R., Razborov A.A., Semenov A.L., Uspenskii V.A.
  - в журнале Russian Mathematical Surveys, издательство Turpion — Moscow Ltd. (United Kingdom), том 61, № 3, с. 575-588
- - 2006 Сергей Иванович Адян (к 75-летию со дня рождения)
  - Беклемишев Л.Д., Лысенок И.Г., Мальцев А.А., Новиков С.П., Пентус М.Р., Разборов А.А., Семенов А.Л., Успенский В.А.
  - в журнале Успехи математических наук, издательство Наука (М.), том 61, № 3, с. 179-191
Статьи в сборниках
- - 1997 Equivalence of multiplicative fragments of cyclic linear logic and noncommutative linear logic
  - Pentus Mati
  - в сборнике Logical Foundations of Computer Science, 4th International Symposium, LFCS’97, Yaroslavl, Russia, July 6-12, 1997, Proceedings, серия Lecture Notes in Computer Science, место издания Springer-Verlag Berlin, том 1234, с. 306-311 DOI
  - редактор Адян Сергей Иванович
Книги
Доклады на конференциях
Тезисы докладов
НИРы
- - 1 января 2021 — 31 декабря 2025 Алгоритмические и семантические вопросы математической логики. 2021-2025
  - Кафедра математической логики и теории алгоритмов
  - Руководитель: Семёнов А.Л. Ответственные исполнители: Золин Е.Е., Пентус М.Р. Участники НИР: Беклемишев Л.Д., Белов А.Я., Верещагин Н.К., Крупский В.Н., Кузнецов С.Л., Любецкий В.А., Плиско В.Е., Сорокин А.А., Шехтман В.Б., Яворская Т.Л.
- - 1 января 2016 — 31 декабря 2020 Алгоритмические и семантические вопросы математической логики. 2016-2020
  - Кафедра математической логики и теории алгоритмов
  - Руководители: Семёнов А.Л., Успенский В.А. Ответственные исполнители: Золин Е.Е., Пентус М.Р. Участники НИР: Адян С.И., Беклемишев Л.Д., Верещагин Н.К., Крупский В.Н., Кузнецов С.Л., Любецкий В.А., Плиско В.Е., Семёнов А.Л., Сорокин А.А., Шехтман В.Б., Яворская Т.Л.
Стажировки в организациях
Участие в редколлегии журналов
Участие в программных комитетах конференций
Руководство диссертациями
Руководство дипломными работами
Руководство курсовыми работами
Авторство учебных курсов
Преподавание учебных курсов

Авиабилеты Мати — Сан-Игнасио туда и обратно. Билеты на самолет Мати

Дешевые авиабилеты из Мати в Сан-Игнасио-Де-Моксо

Хотите купить билет на самолет из Мати в Сан-Игнасио-Де-Моксо по самой низкой цене? Мы сравниваем цены на прямые рейсы Мати — Сан-Игнасио и перелеты с пересадкой среди 750 авиакомпаний и агентств. Зачем зря тратить свое время на поиск, если есть более удобная возможность воспользоваться скидками, акциями и распродажами лоукостов через интернет. С помощью полного расписания самолетов Мати — Сан-Игнасио вы быстро найдете нужный вариант перелета, уточните дни полетов и наличие авиабилетов на конкретную дату.

Для онлайн покупки или бронирования нужно определиться лишь с несколькими пунктами: тип перелета, количество пассажиров, класс и дата вылета-прилета. Потом перейдите к оплате билета, и дело будет сделано. Вы получите письмо на электронную почту с информацией о заказе.

Стоимость авиабилета Мати — Сан-Игнасио

Cколько стоит билет на самолет до Сан-Игнасио-Де-Моксо из Мати и как приобрести дешевле? У нас есть несколько рекомендаций, взятых из календаря лучших цен на авиабилеты по этому маршруту:

1) Ценообразование зависит от месяца вылета, советуем бронировать первый и бизнес-класс заранее. Покупкой авиабилета эконом-класса также затягивать не стоит — делайте это за 2-4 месяца.
2) Самые дешевые билеты на самолет MXI — SNM доступны в среду и четверг. Как правило, на выходных они стоят дороже.
3) Выгодней сразу покупать билеты в обе стороны, чем туда и обратно по отдельности.

Полезная информация перед бронированием путешествия из Мати в Сан-Игнасио-Де-Моксо

На нашем сервисе вы можете узнать:

Расстояние и длительность перелета (сколько лететь из Мати в Сан-Игнасио?)
Какие авиакомпании осуществляют прямые рейсы в Сан-Игнасио из Мати
У каких авиакомпаний самые дешевые билеты из Мати в Сан-Игнасио
Сколько длится перелет из Мати в Сан-Игнасио
Из каких аэропортов можно добраться в Сан-Игнасио из Мати?

На каком расстоянии Мати от Сана-Игнасио-Де-Мокса?

От города Мати до Сана-Игнасио-Де-Мокса 18439 км.

Из каких аэропортов осуществляются перелеты по маршруту Мати — Сан-Игнасио?

В городе Мати: Мати. В Сан-Игнасио — Сан-Игнасио.

в месяц каши приглашает детей готовить самостоятельно – BUSINESS-M – Информационно-деловой Портал

С 1 октября, в Эстонии стартовал традиционный месяц каши, а 10 октября будет отмечаться День Каши. Предлагающая наиболее широкий выбор зерновых продуктов компания Veski Mati уже четвертый год проводит в школах Эстонии специальную программу, чтобы продемонстрировать преимущества здорового питания и употребления каши.

Цель посвященной кашам программы заключается в том, чтобы рассказать детям Эстонии о здоровой злаковой пище, сбалансированном питании и побудить их есть на завтрак каши. В рамках программы вместе с учителем дети могут протестировать различные рецепты из злаков – в первую очередь каши – и придумать свои собственные.

Согласно результатам исследований, средний житель Эстонии ежегодно потребляет около 73 кг зерновых продуктов: вдвое меньше, чем рекомендовано международными организациями здравоохранения. «Мы хотим призвать всех жителей страны, особенно детей, есть на завтрак кашу. Это может стать хорошей привычкой для многих семей и школ. Каша – отличное начало дня, она обеспечивает организм полезными питательными веществами», – сказал Лаури Политанов, председатель правления Balti Veski AS, известного брендом Veski Mati организатора посвященной кашам программы.

К программе могут присоединиться все ученики 1-8 классов (для этого нужно, чтобы учитель зарегистрировал класс на сайте ЗДЕСЬ::

Каждый участник получит диплом с выражением благодарности и книгу рецептов, в составлении которой участвовали Ленна Куурма, Геттер Яани, Мерле Лийвак, Кристель Ааслайд, Отт Лепланд и Уку Сувисте.

Победивший класс определится в результате розыгрыша 23 октября. Приз – интересный вечер с любимыми звездами в таллиннском ресторане Vapiano торгового центра Solaris 31 октября.

На финальном мероприятии также определится любимая каша эстонских школьников 2019 года. Этот титул достанется каше, которую дети чаще всего самостоятельно готовили в рамках месяца каши.

Кроме того, в рамках месяца каши состоится творческий конкурс, где детей пригласят мастерить и подарить новую жизнь упаковкам из-под каши. Конкурс пройдет в двух категориях: 1-3 классы и 4-8 классы. Класс, победивший в первой категории, сможет посетить центр батутов Happy Fly, а победивший во второй категории – получит билеты в кинотеатр Forum Cinemas.

«Эстонские школьники очень интересуются повторным использованием и экологичным образом жизни. Все это важно и для Veski Mati. Мы приглашаем детей поделиться идеями о том, что интересного или полезного можно сделать из упаковок от каши. Мы с нетерпением ждем классных решений – чем необычнее, тем лучше», – отметил Политанов.

В прошлом году в программе приняли участие более 6500 эстонских школьников, которые в ходе тестирования рецептов съели около 1,3 тонны каши и других зерновых продуктов.

Подробнее о программе можно узнать на сайте ЗДЕСЬ:: и на странице Pudruprogramm в Facebook.

Сегодня под брендом Veski Mati компания Balti Veski AS предлагает наиболее широкий в Эстонии ассортимент сухих бакалейных товаров. Balti Veski AS входит в крупнейший в странах Балтии зерновой концерн Baltic Mill.

Фото: Veski Mati

Post Views: 427

Mati объявляет о финансировании серии 13,5 млн долларов на создание инструментов цифровой репутации для «экономики доверия»

Mati — это совершенно новая категория инструментов цифровой репутации для укрепления доверия между онлайн-сервисами и потребителями.

Твитнуть Партнер
Tribe Capital Арджун Сетхи войдет в совет директоров Mati.
«Наша основная цель в Tribe — выявлять и развивать такие определяющие поколения компаний, как Mati», — сказал Арджун Сетхи из Tribe Capital . «Мати создает совершенно новую категорию инструментов цифровой репутации, которые укрепляют доверие между онлайн-сервисами и потребителями, решая важнейшую отраслевую задачу.Мы очень рады поддержать Филипа и его команду, которые революционизируют взаимодействие между сервисами доверия и онлайн-сервисами ».
С момента своего запуска в 2017 году Mati позволил более 200 трастовым компаниям сосредоточиться на своей основной компетенции без необходимости создавать весь стек цифровой репутации в -house.
«На отраслевом уровне мы лишь поверхностно оцениваем последствия того, что Mati помогает онлайн-сервисам обосновывать свои взаимодействия на проверенных пользовательских данных и устранять анонимность в Интернете, чтобы создатели доверительных сервисов могли запускать и масштабировать более безопасный, удобный способ «, — сказал Филип Виктор, генеральный директор и соучредитель Mati .«Благодаря этим инвестициям мы рады возглавить переход от экономики свободного заработка и совместного использования к« экономике доверия »».
Новое финансирование позволит Mati укрепить свой впечатляющий рост, который с 2019 года увеличивался более чем в четыре раза в год. Это укрепит свои позиции в Латинской Америке и будет стимулировать расширение в другие быстрорастущие регионы, где проблемы с идентификацией препятствуют широкому доступу на рынки финансовых услуг, концертов и совместного использования.
«Латинская Америка — очевидный рынок, которым мы должны заняться в первую очередь, учитывая высокий уровень внедрения цифровых технологий в регионе, рост гиг-экономики и прогрессивное регулирование финансовых технологий», — сказал Филип Виктор .«API цифровой репутации Mati помогут концертным сервисам лучше понимать и обслуживать своих пользователей, даже если эта инфраструктура идентификации отсутствует».
Еще одной важной областью постоянных инвестиций Mati будет конфиденциальность и безопасность данных потребителей. С Mati конечные пользователи имеют полную свободу выбора в отношении того, какие элементы своих юридических, финансовых и других данных о репутации они передают и с кем они делятся ими.
Сима Ганди, бизнес-ангел и бывший руководитель отдела развития бизнеса и стратегии Plaid , сказал: «Мати — это редкое сочетание дальновидного основателя, талантливой команды и продукта, который определяет будущее цифровых финансовых технологий в Мир.Мати поможет людям во всем мире получить доступ к финансовым продуктам, установив цифровые связи между людьми и их информацией ».
Благодаря этому сбору средств общий объем собранных на сегодняшний день средств достиг 18,5 миллионов долларов, и он состоится вскоре после того, как Мати объявил о начальном раунде, проводимом Spero Ventures в мае 2020 года.
О Mati
Mati — это комплексное решение для цифровой репутации, которое включает новый уровень доверия к конфиденциальности, который превращает анонимных незнакомцев в надежных людей в сети.Mati предлагает решения для строителей по всему спектру: от разработчиков, использующих онлайн-сервисы с высоким уровнем доверия, до предприятий, поддерживающих процессы проверки пользователей и репутации. Компания Mati, основанная в Сан-Франциско в 2017 году, теперь работает по всему миру, и ей доверяют более 200 клиентов по всему миру. Чтобы узнать больше, посетите getmati.com.
О компании Tribe Capital
Tribe Capital — это венчурная компания на ранней стадии, ориентированная на распознавание и усиление соответствия продукта рынку на ранней стадии.Компания Tribe была основана в Сан-Франциско в 2018 году бывшими партнерами Social Capital и специалистами по обработке данных. Известные инвестиции включают Carta, Instabase, Bolt и Front. Чтобы узнать больше, посетите tribecap.co .
Контакт для СМИ
Meghna Mann
[электронная почта защищена]
ИСТОЧНИК Mati
Ссылки по теме
https://www.getmati.com
границ | MATI, новый белок, участвующий в регуляции сигнальных путей, связанных с травоядными
Введение
Растения — это сидячие организмы, которые полагаются на батарею механизмов для обнаружения патогенов и вредителей с целью выработки соответствующих защитных реакций.В частности, растения развили конститутивную и индуцибельную защиту для сдерживания членистоногих-фитофагов, а также косвенную защиту, используя летучие вещества и нектары для привлечения естественных врагов насекомых-фитофагов и акари (Wu and Baldwin, 2010; Santamaria et al., 2013). В рамках этой защиты растения, зараженные травоядными животными, также могут выделять летучие вещества, чтобы предупредить соседние растения о неминуемой угрозе (Muroi et al., 2011; Schuman and Baldwin, 2016). Параллельно с этим травоядные животные реагируют на защитные механизмы растений, разрабатывая несколько стратегий, чтобы избежать их (Elzinga and Jander, 2013; Suchan and Alvarez, 2015), а растения контратакуют, чтобы реализовать экстренные меры (Hao et al., 2008; Schmelz et al., 2012).
Индукция защиты растений инициируется, когда специфические рецепторы распознают либо присутствие травоядных (через распознавание молекулярных паттернов, связанных с травоядными; HAMP), повреждение тканей растений в результате питания травоядных (молекулярный паттерн, связанный с повреждениями; DAMPs) или присутствие летучих веществ, выделяемых как растительные сигналы (Frost et al., 2007; Schuman and Baldwin, 2016). Распознавание этих молекулярных паттернов запускает пути трансдукции, которые активируют экспрессию защитных генов.Физиологически ранние события во взаимодействиях растения и травоядных начинаются с деполяризации мембранного потенциала в месте питания, изменения клеточной мембраны и ионного дисбаланса с последующими изменениями внутриклеточного Ca ²⁺ и генерацией активных форм кислорода (ROS) (Fürstenberg-Hägg и др., 2013). Каскад протеинкиназ (CDPK) в качестве белков-сенсоров кальция приводит к синтезу фитогормонов и активации факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию генов широкого спектра видоспецифичных соединений с антипитательными, сдерживающими, репеллентными и токсическими свойствами, которые функция улавливания, подавления, блокирования или изменения метаболизма, развития и плодовитости членистоногих-фитофагов (Wu and Baldwin, 2010; War et al., 2012; Сантамария и др., 2013). Транскриптомные и протеомные профили хозяев после кормления членистоногих, откладки яиц или внесения секретов насекомых продемонстрировали, что растения могут различать травоядных и активировать специфические реакции растений (Giri et al., 2006; Kempema et al., 2007; Sotelo et al., 2014; Bandoly et al., 2015). Метаболомные подходы подтвердили способность растений различать виды травоядных и определять начало непрямых защитных реакций, дополняющих прямые защиты (Hettenhausen et al., 2013). Хотя понимание взаимодействия растений и членистоногих все еще находится в зачаточном состоянии, известно, что защитные механизмы растений, локально или системно индуцируемые травоядными животными, регулируются сложным гормональным взаимодействием (Erb et al., 2012; Wang and Wu, 2013; Gimenez-Ibanez и др., 2016). Центральными фитогормонами, которые являются посредниками между распознаванием сигналов и активацией защитных механизмов, являются жасмоновая кислота (JA), салициловая кислота (SA) и этилен (Et). В целом JA регулирует индуцированную защиту от жевательных насекомых (Schmiesing et al., 2016), мезофилл-присосками (Zhurov et al., 2014; Alba et al., 2015; Martel et al., 2015) и некротрофными патогенами (Goossens et al., 2016), а также механическими ранениями (Pieterse et al. ., 2009). SA-регулируемые ответы индуцируются насекомыми, питающимися флоэмами (Kawazu et al., 2012; Thaler et al., 2012), мезофилловыми клещами (Kant et al., 2004) и биотрофными патогенами (Gimenez-Ibanez et al., 2016). ), тогда как Et, скорее всего, модулирует действие обоих гормонов (Campos et al., 2014). Травоядность также приводит к окислительному стрессу, изменениям внутриклеточного pH и высыханию, которые прямо или косвенно модулируют путь JA через действие других гормонов, таких как абсцизовая кислота (ABA) (Hillwig et al., 2016). Другие находки также предполагают важную роль ауксинов, цитокининов и брассиностероидов (Diezel et al., 2009; Erb et al., 2012; Mur et al., 2013). Однако необходимо лучшее понимание перекрестных помех фитогормонов, трансформирующих исходные события восприятия в соответствующие реакции.
Клещи-фитофаги проникают в паренхиматозные клетки растений с помощью стилетов для высасывания питательных веществ и вызывают тяжелый хлороз, приводящий к снижению урожайности (Park and Lee, 2002; Farouk and Osman, 2011; Bensoussan et al., 2016). Среди клещей-фитофагов двухпятнистый паутинный клещ Tetranychus urticae — это вид, который питается более чем 1100 растениями-хозяевами, включая широкий спектр декоративных растений, тепличных культур, а также однолетних и многолетних полевых культур (Migeon and Dorkeld, 2006–2015 гг. ). T. urticae представляет собой модель хелицеральных травоядных животных с секвенированным геномом и широким набором инструментов и разработанных протоколов (Grbic et al., 2011; Santamaria et al., 2012b; Cazaux et al., 2014). Способность клещей питаться Arabidopsis thaliana и широкодоступные наборы инструментов для этого вида растений предоставили прекрасную возможность для функциональных исследований взаимодействия растений и клещей (Santamaria et al., 2012а, 2015; Журов и др., 2014). Кроме того, из-за воздействия паутинного клеща в сельском хозяйстве исследования реакции растений на заражение клещами также проводились на сельскохозяйственных культурах (Maserti et al., 2011; Agut et al., 2015; Diaz-Riquelme et al., 2016). В томате подчеркивается защитный эффект железистых трихомов, обогащенных ацилсахарами или терпеноидами, против паутинных клещей (Resende et al., 2002; Alba et al., 2009; Bleeker et al., 2012), а также репеллентность и сдерживание откладки яиц. индуцируется экстрактами листьев с высокими концентрациями метилкетонов (Antonious and Snyder, 2015).Защита томатов от T. urticae также включает выброс различных летучих соединений, связанных с привлечением хищника паутинного клеща Phytoseiulus persimilis (Ament et al., 2004). JA является важным, но не уникальным гормоном для установления защитных реакций, вызванных паутинным клещом (Kant et al., 2004; Ament et al., 2006; Zhurov et al., 2014; Martel et al., 2015). Питание паутинных клещей также запускает защитные пути SA растений (Kant et al., 2004; Zhurov et al., 2014). Как следствие, растения, вероятно, используют этот баланс JA / SA для точной настройки защитных реакций. Однако паутинные клещи могут манипулировать защитными механизмами растений после гормональных перекрестных помех посредством неизвестного механизма, вызывающего значительные экологические издержки (Kant et al., 2008; Glas et al., 2014; Alba et al., 2015; Wybouw et al., 2015). Недавно Villarroel et al. (2016) определили эффекторные / элиситорные белки в слюне клещей, способные подавлять защитные механизмы растений, расположенные ниже по течению от СК в табаке, и, как следствие, способствовать репродуктивным функциям клещей.Эта экспрессия белка слюны зависит от растения-хозяина (Jonckheere et al., 2016).
В этой работе охарактеризован ген Arabidopsis AT3G14395 неизвестной функции, названный иммунитетом, вызванным атакой клеща (MATI) . Ген MATI был выбран для дальнейшей характеристики, поскольку он демонстрировал стабильно более высокие уровни экспрессии в устойчивом штамме Bla-2 по сравнению с восприимчивыми образцами Kon Arabidopsis после кормления клещами. Этот предыдущий результат побудил нас изучить его потенциальные защитные свойства в качестве защитного гена для борьбы с членистоногими-фитофагами.Здесь мы демонстрируем, что этот ген кодирует новый небольшой белок, который способствует защите растений от травоядных животных за счет модуляции окислительно-восстановительного статуса растений и гормональных сигнальных путей.
Материалы и методы
Растительный материал и условия роста
Arabidopsis thaliana Образцы Col-0, Kondara (Kon) и Bla-2 (Bla-2) (Nottingham Arabidopsis Seed Collection) использовали в качестве образцов дикого типа (WT). A. thaliana Мутанты Т-ДНК (SALK_092139C, N672907, обозначенные в этой статье как mati ) были получены из Центра биологических ресурсов арабидопсиса (ABRC) через Европейский фондовый центр арабидопсиса (NASC).Встраивание Т-ДНК, гомозиготный статус и уровни экспрессии генов линий Salk были подтверждены с помощью общепринятых ПЦР и количественных анализов RT-qPCR (описанных ниже) (дополнительный рисунок 1A). Для роста в почве семена высаживали и инкубировали 5 дней при 4 ° C. Для роста in vitro семена стерилизовали поверхность 75% (об. / Об.) Этанолом, сушили и высевали на чашки Петри, содержащие 0,53 г солей Мурашиге и Скуга (Sigma – Aldrich), 1% (мас. / Об.) сахароза, 0,5 г / л MES и 0,4% (мас. / об.) Phytagel (Sigma – Aldrich), доведенный до pH 5.7 с КОН. Затем растения и чашки выращивали в камерах для выращивания (Sanyo MLR-350-H) в контрольных условиях (23 ° C ± 1 ° C, относительная влажность> 70% и фотопериод день / ночь 16 часов / 8 часов).
Для создания линий сверхэкспрессии кДНК MATI из растений Col-0 клонировали в бинарные векторы шлюза pGWB2 (CaMV35S, без метки) и pGWB5 (CaMV35S, C-sGFP) (Nakagawa et al., 2007) с использованием включенных специфических праймеров. в дополнительной таблице 1. Рекомбинантные плазмиды вводили в A.thaliana Col-0 с использованием трансформации цветочным окунанием Agrobacterium (Clough and Bent, 1998), растений Col- MATI и Col- MATI -GFP в этой статье. Плазмиды pGWB2 были также введены в растения Kon A. thaliana , названные в этой статье растениями Kon- MATI . Ростки регенерировали на селективной среде, содержащей гигромицин (100 мг / л), и первичным трансформантам (Т0) давали возможность самооплодотворяться. Затем отбирали растения и дважды самоопыляли их, чтобы получить линии третьего поколения (Т3).Для наших экспериментов были отобраны гомозиготные растения с одной единственной копией вставки и наивысшими уровнями экспрессии трансгена, полученными в результате различных событий трансформации (дополнительный рисунок 1A).
Анализ экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)
Анализы
RT-qPCR использовались для различных целей: (i) для проверки данных транскриптомного анализа; (ii) для определения гомозиготного статуса мутантных линий Солка; (iii) изучить экспрессию гена MATI в основных тканях Arabidopsis. A. thaliana розетки из образцов Col-0, Bla-2 и Kon отбирали через разное время заражения клещами (1, 3, 6, 12 и 24 ч) для подтверждения результатов микроматрицы. Тотальную РНК экстрагировали согласно Oñate-Sánchez and Vicente-Carbajosa (2008) и подвергали обратной транскрипции с использованием Revert Aid ^TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Были также получены кДНК из A. thaliana Col-0 цветков, корней, стеблей, листьев из стеблевых розеток в возрасте от 1 до 3 недель.RT-qPCR выполняли для трех образцов, взятых из трех независимых экспериментов, как описано ранее (Santamaria et al., 2012a), с использованием системы обнаружения SYBR Green (Roche) и программного обеспечения CFX Manager Software 2.0 (Bio-Rad). Экспрессия генов обозначается как относительные уровни экспрессии (2 ^-ΔCt) или кратное изменение (2 ^-ΔΔCt) (Livak and Schmittgen, 2001). Аналогичным образом уровни экспрессии генов, участвующих в гормональных сигнальных путях, анализировали в розетках из Col- MATI _4.1, — mati и растения WT в трех образцах, полученных из трех независимых экспериментов с незараженными 1 и 24-часовыми зараженными растениями (20 клещей / растение). Количественное определение мРНК выражали в виде относительных уровней экспрессии (2 ^-ΔCt), нормированных на убиквитин (Livak and Schmittgen, 2001). Конкретные праймеры были разработаны с помощью ссылки для разработки праймеров Т-ДНК Института Солка или с помощью программы PRIMER 3. Последовательности праймеров указаны в дополнительной таблице 1.
Структурно-эволюционный
MATI Анализ генов
Иммунитет, вызванный атакой клещей Последовательности были загружены с веб-сайта TAIR.Аминокислотная последовательность была подвергнута поиску последовательности в базе данных Pfam v28.0 и программе SignalP 4.1 для идентификации возможных доменов и сигнального пептида в белке соответственно. Белки MATI из разных видов растений были скомпилированы с использованием GreenphylDB v4 и выровнены с помощью MUSCLE v3.8. Филогенетическое дерево было построено методом максимального правдоподобия PhyML v3.0 с использованием стартового дерева BIONJ и применением теста приблизительного отношения правдоподобия (aLRT) в качестве статистического теста для поддержки непараметрических ветвей.Отображаемые деревья визуализировались в программе MEGA 6.0. Консервированные сайты были проанализированы путем нанесения логотипов последовательностей, представляющих профили скрытых марковских моделей, с использованием инструмента Skytign. Для анализа дивергенций продукта гена MATI среди образцов Arabidopsis его кДНК из розеток Col-0, Bla-2 и Kon клонировали и секвенировали с использованием pGEM ^® -T Easy Vector Systems. Три последовательности были выровнены с использованием Clustal W 1.83.
Субклеточная локализация MATI-GFP в эпидермальных клетках лука и
A.thaliana Линии сверхэкспрессии Расположение белка иммунитета
, инициированного атакой клеща, в клеточных компартментах было проанализировано с помощью двух экспериментальных подходов с использованием слияния MATI гена с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Во-первых, были выполнены анализы временной экспрессии путем бомбардировки частицами эпидермальных слоев лука, а во-вторых, стабильная трансформация растений Arabidopsis. Открытая рамка считывания (ORF) гена MATI , трансляционно слитого с N-концом всего репортерного гена, была клонирована в бинарный вектор pGWB5 в соответствии с инструкциями технологии Gateway.В качестве контроля использовали плазмиду psmRS-GFP, содержащую промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (Davis and Vierstra, 1998), и плазмиду pRTL2ΔNS / ss-RFP-HDEL, содержащую сигнальную последовательность хитиназы арабидопсиса и сигнал извлечения C-концевого HDEL ER, белок которого специфически локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) (Shockey et al., 2006). Временную трансформацию эпидермальных клеток лука ( Allium cepa ) проводили путем совместной бомбардировки частицами с помощью устройства биолистической гелиевой пушки (DuPont PDS-1000 / Bio-Rad), как описано ранее (Diaz et al., 2005). Флуоресцентные изображения получали через 24 часа инкубации при 22 ° C в темноте под конфокальным микроскопом LEICA SP8 (Leica). Для субклеточной локализации слитого белка MATI-GFP в A. thaliana проростки линии Col- MATI _4.1-GFP наблюдали под конфокальным микроскопом LEICA SP8 (Leica) с использованием соответствующих фильтров.
Уход за паутинным клещом и свекольной совкой и анализ физической формы
Чтобы проверить участие MATI в ответах растений на травоядность , T.urticae и Spodoptera exigua , биотесты при кормлении были выполнены в линиях мутанта mati- и Col-0 Arabidopsis со сверхэкспрессией MATI. Колония T. urticae , штамм London (Acari: Tetranychidae), предоставленная доктором Миодрагом Грбичем (UWO, Канада), была выращена на бобах ( Phaseolus vulgaris ) и содержалась в камерах для выращивания (Sanyo MLR-350-H ) при температуре 23 ° C ± 1 ° C, относительной влажности> 70% и фотопериоде день / ночь 16 часов / 8 часов. Клещи были синхронизированы путем инокуляции 100 взрослых самок (случайный возраст) на один лист фасоли, заключенный в замкнутую систему под пропитанным водой хлопком.Через 1 день взрослых самок удаляли, а через 10 дней популяция на листе была синхронизирована. Развитие и поведение паутинного клеща изучали на растениях Col- MATI _4.1, _5.2, mati и Col-0 WT. T. urticae Анализ плодовитости был проведен на отдельных листьях трехнедельных растений. Свежий лист (длиной около 1 см) с каждого растения помещали в специальные чашки и заражали 12 взрослыми синхронизированными самками. Через 36 часов заражения подсчитывали количество яиц.Для определения генотипа растений использовали восемь повторов.
Spodoptera exigua яйца любезно предоставлены доктором. Ф. Будиа и Э. Виньуэла (Департамент агрономической продукции, ETSI Agronomos-UPM, Испания). Личинок содержали в ящиках, питающихся искусственным кормом (Poitout and Bues, 1970), в камерах для выращивания (Sanyo MLR-350-H) при 25 ° C ± 1 ° C, относительной влажности> 70% и продолжительности рабочего дня 16 часов / 8 часов. / ночной фотопериод. Ящики были выложены фильтровальной бумагой для уменьшения влажности. Вермикулит был предоставлен для окукливания, когда личинки завершили цикл своего развития.Взрослым позволяли выйти в цилиндрических контейнерах с 10% -ным (об. / Об.) Водным раствором меда. Яйца откладывали на полоски фильтровальной бумаги, и новорожденных (24 часа) и личинок L1 (48 часов) синхронизировали для анализов поведения растений и травоядных, соответственно. Продуктивность личинок проверяли путем помещения трех только что вылупившихся (новорожденных) личинок совки-совки на трехнедельные растения разных генотипов (линии Col- MATI _4.1, — mati и WT) и определяли вес личинок. измеряли на прецизионных весах Mettler-Toledo MT5 (Mettler-Toledo) через 4 дня кормления.Для каждого генотипа использовали двенадцать повторов.
Определение повреждения растений
Количественную оценку повреждения растений после кормления членистоногих проводили на целых растениях Arabidopsis T2 из выбранных гомозиготных трансгенных линий (Col- MATI _4.1, Col- MATI _5.2; Col- mati , Kon- MATI ). _6.1 и Kon- MATI _7.2) и из нетрансформированных элементов управления Col-0 и Kon. Трехнедельные растения заражали 20 взрослых особей T. urticae, взрослых на растение.По данным Cazaux et al., После 4 дней кормления повреждение листьев оценивали путем сканирования всей розетки с помощью HP Scanjet (серия цифровых планшетных сканеров HP Scanjet 5590). (2014). Повреждение листа рассчитывали в мм ² с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop CS. Для каждого генотипа использовали шесть повторов.
Листовые диски (диаметр 7 мм) 3-недельных растений трех генотипов Col-0 (WT, Col- MATI _4.1 и Col- mati ) инфицировали двумя новорожденными личинками S.exigua. Через 12 ч листовые диски сканировали с помощью hp scanjet (серия цифровых планшетных сканеров HP Scanjet 5590). Повреждение листа было рассчитано в мм ² с использованием инструмента разделения каналов из программного обеспечения imageJ. Для каждого генотипа использовали 32 повтора.
Анализы совместной иммунопреципитации
Для идентификации партнеров по взаимодействию с MATI белковые экстракты из контрольных растений и растений Col- MATI -GFP были иммуноочищены с использованием системы GFP-Trap и проанализированы в LTQ-Orbitrap Velos.Пять граммов свежей массы растений Col-GFP WT и Col-MATI-GFP (линия Col-MATI_4.1), выращенных в течение 3 недель на среде MS половинной крепости, замораживали в жидком азоте, экстрагировали растиранием с помощью ступки и пестика. и добавляли к 15 мл холодного буфера для экстракции TAP (50 мМ TRIS-HCl, 150 мМ ClNa, 10% (об. / об.) глицерина, 0,8% (об. / об.) тритона и 0,4% (мас. / об.) Chaps (Sigma) и полный коктейль ингибиторов протеаз (Roche). Этот лизат центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C и количество белка в супернатанте определяли количественно с помощью Nanodrop ^® ND1000.Эксперименты по совместной иммунопреципитации (Co-IP) растений Arabidopsis, экспрессирующих GFP-меченные белки, проводили с использованием гранул GFP-Trap ^® (ChromoTek GmbH), следуя рекомендациям производителя. Иммуно-преципитированные белки были обнаружены с помощью иммуноблот-анализа на нитроцеллюлозных мембранах (GE Healthcare) с использованием моноклональных антител против GFP (Miltenyi Biotec) при разведении 1: 5000 в блокирующем буфере BSA, содержащем 3% (WV) PBS и 0,05% (V / V) Твин-20. Акриламидные гели окрашивали Кумасси и Иволга (Bio-Rad) для выявления предполагаемых взаимодействий.
Протеомный анализ
Коиммунопреципитированных белков из образцов Col WT (Col-0) и Col- MATI _4.1 переваривали и анализировали в LTQ-Orbitrap Velos (Gil-Bona et al., 2015). Идентификацию пептидов по необработанным данным проводили с использованием лицензионной версии поисковой системы MASCOT 2.3.0 и Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific). Поиск в базе данных выполнялся по базам данных UniProt-Swissprot и NCBInr с таксономическим ограничением до A. thaliana . Для поиска использовались следующие ограничения: триптическое расщепление после Arg и Lys, до двух допустимых пропущенных сайтов расщепления и допуски 20 ppm для ионов-предшественников и 0.6 Да для ионов фрагмента МС / МС. Кроме того, были выполнены поиски, позволяющие осуществить возможное окисление метионина и фиксированное карбамидометилирование цистеина. Поиск по базе данных-приманок (интегрированный подход-приманка) использовался для расчета FDR, а фильтр-перколятор MASCOT был применен к результатам MASCOT. Критериями приемлемости для идентификации белка были FDR <1% и по крайней мере один пептид, идентифицированный с высокой достоверностью (CI> 95%). Белки, идентифицированные как предполагаемые взаимодействия MATI, были функционально классифицированы с использованием AgriGO v1.2 и STRING v10. Кроме того, взаимодействие между предполагаемыми партнерами MATI было проанализировано в STRING v10. Протеомный анализ проводился в Proteomics Facility UCM-PCM, входящей в сеть ProteoRed.
Утечка электролита
Деполяризация мембраны быстро происходит после взаимодействия растения с травоядным, за которым следуют изменения клеточной мембраны и ионный дисбаланс, который можно контролировать путем измерения утечки электролита (EL). Диски листьев арабидопсиса (диаметр 1 см) из Col- MATI _4.1, — mati и растения WT заражали 10 клещами и инкубировали в течение 24 часов. EL определяли, как описано Masood et al. (2006). Измерения EL проводили через 2 часа (C1) инкубации при 32 ° C с использованием кондуктометра (EC-Metro BASIC 30, CRISON). Общее содержание электролита определяли таким же образом после кипячения в течение 10 мин (С2). Результаты выражали как процент EL = (C1 / C2) × 100. Для каждого генотипа и лечения использовали шесть повторов.
Измерения фотосинтетического пигмента
Чтобы проверить, изменяют ли растения свой основной метаболизм во время кормления травоядных, чтобы справиться с повышенными метаболическими потребностями, хлорофилл и каротиноиды были проанализированы как стандартные параметры фотосинтетической активности в трех различных генотипах Col-0.Хлорофилл a и b , а также общие каротиноиды экстрагировали из линий Col- MATI _4.1, — mati , WT. Розетки Arabidopsis заражали 10 клещами и инкубировали в течение 24 часов. Сто миллиграмм листьев растирали в ступке с жидким азотом и суспендировали в 10 мл 80% (об. / Об.) Ацетона с использованием фотозащитных пробирок. После центрифугирования при 3000 об / мин в течение 15 минут (центрифуга L344 Eppendorf 5810R) оптическую плотность супернатанта измеряли при 470, 663 и 646 нм для каротиноидов, хлорофилла a и b , соответственно, с использованием УФ-микроскопа. спектрофотометр (UltroSpec ^TM 3300pro, Amersham Bioscience).Для каждого генотипа и лечения использовали шесть повторов. Содержание пигмента рассчитывали с использованием коэффициентов экстинкции и уравнений, определенных Lichtenthaler (1987).
Производство ROS и количественная оценка окрашивания DAB
Накопление H ₂ O ₂ определяли с использованием субстрата 3,3-диаминобензидинтетрахлоридгидрата (DAB) (Sigma – Aldrich), который дает коричневый осадок после окисления в присутствии H ₂ O ₂ (Мартинес де Илардуйя и др., 2003). Диски листьев Col-0 Arabidopsis (диаметр 1 см) из генотипов Col- MATI _4.1, — mati и WT заражали 10 клещами и инкубировали в течение 24 часов. Зараженные и незараженные контрольные диски окрашивали DAB согласно Rodríguez-Herva et al. (2012) и наблюдались под микроскопом Zeiss Axiophot. Специфичность окрашивания DAB была подтверждена в присутствии поглотителя H ₂ O ₂, аскорбиновой кислоты (10 мМ). ImageJ использовали для количественного анализа изображения с использованием вектора DAB метилового зеленого.Было выполнено шесть повторов по генотипу и лечению.
Количественное определение тиолов
Количество тиоловых групп определяли в линиях Col- MATI _4.1, — mati и WT a. Розетки Arabidopsis заражали 10 клещами и инкубировали в течение 24 часов. Двести миллиграмм розеток возрастом 3 недели гомогенизировали с фосфатным буфером (pH 6), центрифугировали при 2500 об / мин при 4 ° C в течение 10 мин. Супернатант использовали для флюорометрического анализа тиоловой группы в соответствии с инструкциями производителя (Sigma – Aldrich).Для каждого генотипа и лечения использовали шесть повторов.
Гормональные анализы
Поскольку гормоны являются важными регуляторными компонентами защитных сигналов, и особенно известно, что JA и SA играют важную роль в регуляции защитных реакций растений против паутинных клещей, накопление JA и SA, а также ABA в зараженных и незараженных Col-0 генотипы также были измерены. Растительные гормоны (OPDA: 12-оксофитодиеновая кислота, JA, JA-Ile, SA и ABA) количественно определяли с помощью масс-спектрометрии изотопного разведения из трехнедельных розеток Col- MATI -4.1, — mati и растения WT после 24 ч кормления паутинным клещом. Шесть розеток объединяли для каждого эксперимента и проводили три независимых эксперимента. Меченые изотопами стандарты добавляли к образцам растений (~ 0,1 г) перед экстракцией, как описано ранее (Durgbanshi et al., 2005). Сверхвысокопроизводительная жидкостная хроматография (UPLC) -электроспрей-ионизация-тандемный масс-спектрометрический анализ выполняли на системе Acquity SDS (Waters), соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Micromass).Количественное определение было выполнено с помощью внешней калибровки.
Статистический анализ
Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа для проверки экспрессии генов, экспрессии в различных тканях и анализа повреждений, а также биоанализов T. urticae и S. exigua . Двусторонний дисперсионный анализ был использован для проверки экспрессии генов, EL, H ₂ O ₂, антиоксидантов, фотосинтеза, метаболитов и исследований экспрессии генов гормонов. Ко всем исследованиям применялся критерий множественного сравнения Стьюдента-Ньюмана-Кеулса.На рисунках значимые различия ( P <0,05) между линиями для разных оцениваемых параметров были отмечены разными буквами. Значения F , P и df (степень достоверности), полученные в результате каждого статистического анализа, собраны в дополнительной таблице 2.
Результаты
MATI , ген, предположительно участвующий в защите Arabidopsis от паутинных клещей
Журов и др. (2014) подчеркнули естественную генетическую изменчивость устойчивости между образцами Arabidopsis T.urticae , идентифицируя Bla-2 и Kon как образцы на противоположных концах спектра. Полногеномный анализ транскрипционных ответов этих образцов показал, что они очень похожи, что привело к заключению, что существенные различия в уровнях метаболитов JA могут лежать в основе их дифференциальной устойчивости к питанию клещами. Среди других аналогичных ответов ген AT3G14395 показал стабильно более высокие уровни экспрессии в устойчивом штамме Bla-2 по сравнению с Kon (рис. 1A).Эти данные были подтверждены анализами RT-qPCR (рис. 1B). Ген AT3G14395 , названный MATI , кодирует специфический растительный белок с неизвестной функцией. Предсказанный белок с массой 8,35 кДа содержит 75 аминокислот без известных доменов и сигнального пептида. Поиски в GreenPhylDB обнаружили, что гомологи белка MATI широко и однозначно присутствуют в покрытосеменных, включая как однодольные, так и двудольные. Филогенетическое дерево было построено с использованием белковых последовательностей гомологов MATI из 27 различных видов, присутствующих в GreenPhylDB (рис. 2А).Филогенетический анализ четко идентифицировал три разные группы, одна из которых образована белками однодольных растений, а две группы — белками двудольных растений (рис. 2). Последовательность MATI была отнесена к группе B двудольных растений вместе с другими пятью дополнительными последовательностями белка. Множественное выравнивание последовательностей показало, что продукт гена MATI был идентичен в образцах Col-0, Bla-2 и Kon (данные не показаны). Дальний паралог, AT1G30260 из A. thaliana , присутствовал в группе двудольных A (рис. 2A), но не был активирован после кормления паутинным клещом в Bla-2 (дополнительный рис. 2).

РИСУНОК 1. Иммунитет, вызванный атакой клеща ( MATI ) ( AT3G14395) Экспрессия гена в образцах Arabidopsis Bla-2, Kon и Col-0 в ответ на заражение Tetranychus urticae . (A) Данные микроматрицы для экспрессии MATI в образцах Arabidopsis Bla-2 и Kon после заражения T. urticae через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после заражения, представленные как Log (2). (B) Проверка на микрочипе экспрессии гена MATI через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после заражения с помощью анализов RT-qPCR.Экспрессия гена, называемая кратным изменением (2 ^-ΔΔCt). Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Различные буквы указывают на значительные различия между временами после заражения в пределах каждого образца ( P <0,05, однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса).

РИСУНОК 2. Эволюционные и последовательные особенности белков MATI. (A) Филограмма гомологов MATI от выбранных растений. Филогенетическое дерево, построенное методом PhyML с использованием гомологов MATI 27 видов растений.Числа — это значения ALRT для статистической поддержки. ARATH, Arabidopsis thaliana ; BRADI, Brachypodium distachyon ; CAJCA, Cajanus cajan ; CARPA, Carica papaya ; CICAR, Cicer arietinum ; CITSI, Citrus sinensis ; COFCA, Coffea canephora ; CUCSA, Cucumis sativus ; ELAGV, Elaeis guineensis ; GLYMA, Glycine max ; ГОСРА, Gossypium raimondii ; HORVU, Hordeum vulgare ; MALDO, Malus domestica ; MANES, Manihot esculenta ; MEDTR, Medicago truncatula ; MUSAC, Musa acuminata ; MUSBA, Musa balbisiana ; ORYSA, Oryza sativa ; PHAVU, Phaseolus vulgaris ; POPTR, Populus trichocarpa ; RICCO, Ricinus communis ; SETIT, Setaria italica ; SOLLY, Solanum lycopersicum ; СОЛТУ, Solanum tuberosum ; СОРБИ, Сорго двухцветное ; THECC, Theobroma cacao ; ZEAMA, Zea mays . (B) Логотипы, представляющие скрытые марковские модели N-концевых частей домена MATI для трех основных идентифицированных групп.

Множественное выравнивание последовательностей гомологов MATI выявило присутствие консервативного N-концевого домена, обнаруженного во всех белковых последовательностях. Пара треонин-изолейцин, за которой следуют несколько отрицательно заряженных аминокислотных остатков на С-конце консервативного домена, неизменно обнаруживалась во всех белках. Кроме того, в большинстве случаев были идентифицированы два остатка пролина ближе к середине домена и несколько заряженных аминокислот, разбросанных вдоль консервативного N-концевого домена (рис. 2В).Таким образом, MATI представляет собой ген с неизвестной функцией, но консервативный как среди однодольных, так и среди двудольных растений, потенциально связанный с реакцией растений на питание паутинным клещом.

Экспрессия гена MATI и субклеточное расположение белка MATI

Для определения экспрессии гена MATI были проведены исследования RT-qPCR в основных тканях Arabidopsis. MATI Уровни экспрессии мРНК в основном обнаруживались в цветках, семенах, стручках и листьях стебля или розетки на разных стадиях развития, в то время как в корнях она почти не обнаруживалась (рис. 3А).Анализы временной экспрессии в слоях эпидермальных клеток лука выполняли для определения субклеточной локализации MATI. ORF MATI , трансляционно слитая с GFP, была обнаружена по всей сети ER, которая была непрерывной с ядерной мембраной. Это субклеточное расположение было выявлено по его совместному расположению с флуоресценцией, испускаемой плазмидой 35S-RFP-HDEL, используемой в качестве контроля местоположения эндомембранной системы (рис. 3Bb, f, j, n). Белок MATI также был обнаружен в плазматической мембране, цитоплазме и в ядре (рис. 3Ba, e).Плазмолиз, индуцированный обработкой 1 М маннитом, подтвердил паттерн расположения MATI в отделенной от клеток плазматической мембране, при этом флуоресценция не наблюдалась ни в клеточной стенке, ни в апопласте (рис. 3Bm, o). Как и ожидалось, контроль 35S-GFP показал флуоресценцию по всей клетке (рис. 3Bi, k). Кроме того, были созданы линии сверхэкспрессии Col- MATI -GFP для подтверждения субклеточной локализации MATI во всем растении. Стабильная экспрессия плазмиды 35S- MATI -GFP в трансгенных растениях Arabidopsis Col-0 подтвердила расположение белка в эндомембранной системе, цитоплазме и ядре, как показано трансгенным в корнях трансгенных растений Arabidopsis (фиг. 3C).

РИСУНОК 3. Иммунитет, вызванный атакой клещей Экспрессия гена в тканях растений и субклеточное расположение белка. (A) Относительные уровни экспрессии гена (2 ^-ΔCt) гена MATI в различных тканях Arabidopsis. Цветы (F), корни (R), семена (S), стручки (Si), листья стебля (Ls) и розетки в возрасте от 1 до 3 недель (LR1, LR2 и LR3). Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на существенные различия ( P <0.05, односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса). (B) Конфокальные стопки, охватывающие эпидермальные луковые клетки, котрансформированные с помощью 35S- MATI -GFP, контроля 35S-GFP и / или контроля 35S-RFP-HDEL. Конфокальные проекции зеленого флуоресцентного белка (GFP) (a, e, i) , RFP (b, f, j) , объединенные (c, g, k) и соответствующие снимки Номарского (d, в, л) . Показаны конфокальные изображения (m, n) и проекции (o, p) локализации MATI после плазмолиза 1 М маннитом. (C) Субклеточное расположение белка MATI в корнях трансгенных линий Col- MATI -GFP. Также показаны наблюдения с ярким полем Номарского (правая панель). Полосы показаны на всех изображениях.

Влияние MATI на устойчивость растений и продуктивность вредителей

Для исследования роли белка MATI в защите растений были созданы молчащие линии ( mati Salk) и линии со сверхэкспрессией Col-0 и Kon Arabidopsis (Col- MAT и Kon- MATI , соответственно).Характеристика гомозиготной линии mati Salk выявила аллель потери функции, генерируемый вставкой Т-ДНК в первую часть экзона (дополнительный рисунок 1A). С другой стороны, анализ экспрессии генов трансгенных растений, экспрессирующих ген MATI конститутивно на фоне Col-0 и Kon, позволил отобрать линии, которые сверхэкспрессировали ORF MATI для дальнейших исследований (дополнительный рисунок 1Ba, b).

Гомозиготный нокаут (Col- mati ), сверхэкспрессирующие линии (Col- MATI _4.1, _5.2 и Kon- MATI _6.1, _7.2), а также соответствующие растения WT были заражены паутинным клещом, и повреждение растений было количественно определено через 4 дня после кормления клещами (Фигуры 4A, C). Линии со сверхэкспрессией Col- MATI показали примерно в три раза меньше повреждений, чем нетрансформированные растения, зараженные Col WT (точно в 2,83 и 2,68 раза для Col- MATI _4,1 и _5,2, соответственно). Точно так же избыточная экспрессия MATI в Kon (Kon- MATI _6.1 и _7.2) приводила к значительному снижению повреждений (1.В 25 и 2,7 раза для Kon- MATI _6,1 и _7,2 соответственно) по сравнению с зараженным Kon WT. Напротив, поврежденная область в нокаутированных линиях Col- mati была примерно в 2,5 раза больше, чем повреждение, определенное количественно в линиях Col-0 WT после кормления клещами. Интенсивность повреждения, измеренная как хлоротическая площадь на зараженных листьях, была пропорциональна уровням экспрессии MATI . Чтобы гарантировать, что хлоротическая область коррелирует с кормлением, усиленным клещами, и не является следствием более значительной гибели клеток, продуктивность клещей определялась после кормления растениями с разными уровнями экспрессии MATI .Анализы плодовитости были выполнены на листьях разных генотипов Col-0 и показали, что синхронизированные клещи, питающиеся растениями WT и mati , имели более высокие показатели плодовитости, чем те, которые питались сверхэкспрессирующими линиями MATI (рис. 4D). Таким образом, большее повреждение листьев отражает способность клещей более интенсивно питаться и быть более плодовитыми, что указывает на то, что избыточная экспрессия MATI коррелирует со способностью растения защищаться от травоядных.

РИСУНОК 4. Повреждение растений генотипов Col-0 и Kon, зараженных T. urticae и Spodoptera exigua , и влияние на продуктивность вредителей. (A) Повреждение листьев Arabidopsis Col-0 (WT, Col- MATI _4.1, _5.2 и Col- mati линии) и Kon (WT, Kon- MATI _6.1 и _7.2) генотипы через 4 дня после кормления T. urticae . (B) Повреждение листьев Arabidopsis Col-0 (линии WT, Col- MATI _4.1 и Col- mati ) через 12 ч после S.exigua кормление. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка 6 ( T. urticae ) и 32 ( S. exigua ) повторов. Разные буквы указывают на значительные различия ( P <0,05, однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса). (C) Фенотипы листьев генотипов Col-0 через 4 дня и 12 часов после кормления T. urticae и S. exigua соответственно. (D) Показатели T. urticae и S. exigua , определяемые как количество яиц клещей и масса личинок совки, после кормления в течение 4 дней и 24 часов соответственно для генотипов Col-0.Данные представляют собой средние значения ± SE 6 ( T. urticae) и 32 (S. exigua) повторностей. Разные буквы указывают на значительные различия ( P <0,05, однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса). Синие полосы (фон Col) и серые полосы (фон Kon).

Чтобы оценить, была ли защита растений, опосредованная геном MATI , специфичной для заражения акари, листовые диски разных генотипов Col-0 были заражены универсальным чешуекрылым, армией свеклы S.exigua и количественно оценили повреждение листьев. Как показано на фиг. 4B, C, поврежденная площадь была значительно выше в линиях Col- mati и Col-0 WT, чем в линии со сверхэкспрессией Col- MATI _4.1. Кроме того, вес личинок после 12 часов кормления растениями Col- mati и WT был в два и 1,5 раза больше, соответственно, по сравнению с весом личинок совки-совки, питавшейся Col- MATI _4.1 ( Рисунок 4D). Следовательно, сверхэкспрессия MATI обеспечивает защиту растений от множества травоядных.

MATI Interactome обнаруживает свое участие в сложной сети

Используя базу данных NCBInr после анализов Co-IP, 94 белка были конкретно обнаружены в образце MATI , но не в контрольном WT. Большинство этих белков было распознано путем идентификации одного пептида (дополнительная таблица 3). Идентифицированные белки были классифицированы в пять различных чрезмерно представленных категорий на основе их биологической функции ГО, связанной с метаболизмом соединений серы, образованием метаболитов-предшественников и энергией, фотосинтезом и метаболизмом серина (дополнительный рисунок 3A).Когда идентификация проводилась с помощью анализа единственного обогащения в AgriGO, чрезмерно представленные категории биологических процессов Go включали окислительно-восстановительные и метаболические процессы, фотосинтез и образование метаболитов-предшественников и энергии (дополнительный рисунок 3B). Кроме того, сеть интерактомов для предполагаемых партнеров MATI выявила обогащение взаимодействий между предполагаемыми взаимодействующими элементами MATI, с 247 наблюдаемыми взаимодействиями по сравнению с 100 ожидаемыми для всего 94 белков.Среди тех партнеров, которые предположительно участвуют в метаболическом процессе соединений серы, было обнаружено 58 взаимодействий по сравнению с ожидаемыми 6 (дополнительный рисунок 3C). Поскольку две основные широко представленные функциональные категории были связаны с метаболизмом серы и фотосинтезом, были дополнительно проанализированы различные параметры, участвующие в этих физиологических процессах.

MATI Модулирует окислительно-восстановительное состояние растений и фотосинтез

Поскольку экспрессия MATI индуцировалась на ранних этапах кормления клещом листьями Arabidopsis, было важно определить, как MATI может модулировать ответы растений на кормление травоядных.Таким образом, EL была определена в генотипах Col-0 после кормления клещами. Результаты показали значительно более высокую утечку, либо конститутивную, либо вызванную клещами утечку в растениях Col- mati , чем в растениях со сверхэкспрессией Col- MATI или в растениях WT (фиг. 5A). Поскольку эти изменения проводимости обычно сопровождаются генерацией ROS, концентрации H ₂ O ₂ были определены в трех генотипах Col-0. Количественное определение H ₂ O ₂ в зараженных растениях, выраженное в единицах DAB, показало, что растения Col-0 WT и Col- mati накапливали примерно в два и десять раз больше DAB, соответственно, чем соответствующие им не- зараженные генотипы.Однако уровни H ₂ O ₂ в зараженной линии Col- MATI_4.1 изменились только примерно в 1,5 раза по сравнению со значениями DAB по сравнению с незараженной линией (фиг. 5B). Поскольку соединения тиолового типа являются важным классом антиоксидантов, которые подавляют химически активные виды окислителей, также количественно оценивались различия в общем содержании тиоловых групп между различными генотипами Col-0. Кормление T. urticae вызвало значительное снижение концентрации тиоловой группы у растений WT и Col- mati , тогда как характер накопления тиолов существенно не изменился в образцах Col- MATI (рис. 5C).

РИСУНОК 5. Редокс-статус и количественная оценка фотосинтетического пигмента в генотипах Arabidopsis Col-0 через 24 часа после кормления T. urticae . (A) Измерения утечки электролита. (B) Накопление перекиси водорода (DAB). (C) Всего тиоловых групп. (D) Всего каротиноидов. (E) Общий хлорофилл. Использовали линии сверхэкспрессии WT, Col- mati и Col- MATI _4.1. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка шести повторов.Разные буквы указывают на существенные различия ( P <0,05, двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса).

Трехнедельные мутантные линии mati , сверхэкспрессирующие и контрольные линии Col были использованы для определения содержания хлорофилла и каротиноидов в присутствии / отсутствии паутинных клещей. В то время как пониженные уровни обоих пигментов наблюдались в зараженных линиях WT и Col- mati , высокое накопление хлорофилла и каротиноидов было обнаружено в сверхэкспрессирующем Col- MATI_4.1 линий после кормления клещами по сравнению с незараженными генотипами (рисунки 5D, E). Следовательно, MATI помогает поддерживать умеренные уровни ROS, необходимые для передачи защитных сигналов, чтобы контролировать окислительно-восстановительный гомеостаз, и сохранять высокие уровни пигментов, чтобы избежать затрат на фотосинтез.

MATI Влияет на защиту растений от клещей посредством модуляции гормональных сигналов

Гормональный анализ показал, что OPDA, JA и его биоактивная форма JA-Ile накапливались в ткани листа в течение первых 24 часов в ответ на кормление паутинным клещом, независимо от генотипа (Рисунки 6A – C).Содержание свободного OPDA увеличивалось в основном в обработанных паутинным клещом линиях Col- MATI и — mati , которые содержали примерно в два раза больше предшественника JA в зараженных WT (фиг. 6A). Накопление JA и JA-Ile также увеличивалось в генотипах Col- mati и WT, но самые высокие уровни гормонов были обнаружены в линиях со сверхэкспрессией Col- MATI после заражения клещами. Было обнаружено увеличение примерно в 45 и 16 раз содержания JA и JA-Ile, соответственно (Фигуры 6B, C).Одновременно в одних и тех же пробах розетки определяли концентрации СК и АБК. Интересно, что высокие уровни СК были накоплены в незараженных линиях Col- MATI , но они были значительно снижены после кормления клещами. Напротив, SA увеличивалась в ответ на заражение в линиях Col- mati и WT (фиг. 6D). Что касается уровней АБК, они увеличивались исключительно у зараженных линий Col- mati (фиг. 6E). Таким образом, MATI участвует в модуляции различных гормональных сигнальных путей в ответ на нападение паутинного клеща.

РИСУНОК 6. Количественная оценка гормонов в генотипах Arabidopsis Col-0, инфицированных T. urticae . (А) OPDA. (B) Жасмоновая кислота (JA). (C) JA-Ile. (D) Салициловая кислота (SA). (E) ABA. Уровни определяли в 3-недельных розетках растений Col- MATI _4.1, Col- mati и WT через 24 ч после кормления паутинным клещом. Значения, выраженные в нг на грамм сырого веса, представляют собой средние значения ± стандартная ошибка шести повторов.Разные буквы указывают на существенные различия ( P <0,05, двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса).

Для дальнейшего анализа молекулярной основы функции гена MATI через 24 часа после кормления клещом был проанализирован паттерн экспрессии некоторых генов, связанных с JA, SA и ABA, расположенных на разных уровнях в гормональных сигнальных путях. Липоксигеназа 3 ( LOX3 ), алленоксид-синтаза ( AOS ), фактор транскрипции MYC2 ( MYC2 ), вегетативный запасной белок 2 ( VSP2 ) и растительный дефенсин ( PDF1.2 ) были отобранными генами для расчленения пути JA. Неинфицированные растения Col WT демонстрировали низкие уровни конститутивной экспрессии всех генов, связанных с JA, но их экспрессия увеличивалась после заражения паутинным клещом. Интересно, что большинство отобранных защитных генов представляли более высокие уровни мРНК в зараженных сверхэкспрессирующих MATI линиях, чем в линиях WT или mati . Только значения экспрессии гена PDF1.2 , относящегося к защитной ветви JA / Et, были ниже в Col- MATI _4.1 сверхэкспрессирующая линия, чем у Col- mati или растений WT (Фигуры 7A-E). Аналогичным образом, изохоризмат-синтаза 1 ( ICS1 ), гены, не экспрессирующие PR gene1 ( NPR1 ) и связанные с патогенезом ( PR1 ), участвующие в биосинтезе SA, регуляции и конечном продукте защиты, соответственно, были отобраны для изучения SA подразумеваемое. Эти три гена показали более низкую экспрессию в зараженных, чем в незараженных линиях Col- MATI , в то время как в линиях Col- mati и WT экспрессия некоторых генов была увеличена, некоторых снижена, а другие не показали различий в ответ на клещей ( Рисунки 7F – H).Кроме того, экспрессия тех же JA- и SA-регулируемых генов была проанализирована в тестах на заражение клещами на ранней стадии, всего через 1 час после нападения клещей. Что касается генов, участвующих в пути JA, LOX3, AOS и MYC2 были активированы после кормления клещами в линиях WT, MATI и mati , в то время как ген VSP2 был исключительно и высоко индуцирован в заражены сверхэкспрессией линий MATI . Любопытно, что ген PDF1.2 индуцировался только в зараженных линиях WT, поскольку его базовые уровни экспрессии в незараженных линиях MATI были выше, чем индуцированные уровни, обнаруженные в растениях WT после кормления клещами.Этот ген не индуцировался в линиях mati , зараженных или не зараженных (дополнительные рисунки 4A – E). Экспрессия генов, участвующих в биосинтезе SA, ICS1, NPR1 и PR1 , была сходной или более низкой в зараженных и незараженных линиях Col- MATI , но их уровни экспрессии в линиях mati не изменились. в ответ на клещей. Напротив, гены ICS1, и NPR1 были активированы в инфицированных линиях WT, а ген PR1 не изменялся (дополнительные рисунки 4F – H).

РИСУНОК 7. Уровни экспрессии генов, связанных с гормонами, в трех генотипах Col-0. (A) Липоксигеназа 3 ( LOX3 ). (B) Синтаза оксида аллена ( AOS ). (C) Фактор транскрипции MYC2 ( MYC2 ). (D) Запасной растительный белок 2 ( VSP2 ). (E) Завод Дефенсин ( PDF1.2 ). (F) Изохоризмат-синтаза 1 ( ICS1 ). (G) Неэкспрессор гена PR 1 ( NPR1 ). (H) Связанные с патогенезом ( PR1 ). Гены анализировали в растениях Arabidopsis Col- MATI _4.1, Col- mati и WT через 24 ч после кормления клещами. Уровни экспрессии генов были нормализованы к экспрессии гена убиквитина. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка шести повторов. Разные буквы указывают на существенные различия ( P <0,05, двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса).

Кроме того, были проверены три гена, относящиеся к пути ABA: дефицит ABA 1 ( ABA1 ), регуляторный компонент рецептора ABA 3 ( RCAR3 ) и Responsive to Dessication 22 ( RD22 ).Ген ABA1 уменьшился после заражения клещами по той же схеме экспрессии во всех генотипах, но гены RCAR3 и RD22 увеличились исключительно в нокдаун-линиях mati после заражения клещами (дополнительный рисунок 5). Все эти результаты согласуются с гормональным содержанием, измеренным в генотипах MATI со сверхэкспрессией и нокдауном, и подтверждают важность MATI в регуляции различных гормональных сигнальных путей.

Обсуждение

В последние годы было проведено множество исследований для раскрытия молекулярных событий растений в ответ на членистоногих-фитофагов, которые выявили сложную комбинацию метаболических, онтогенетических и сигнальных сетей (Wu and Baldwin, 2010; War et al., 2012; Johnson et al., 2016; Шуман, Болдуин, 2016). В этом сценарии идентификация и дальнейшая характеристика новых молекул, соединений и путей, участвующих в защите, и понимание механизмов защиты растений имеют важное значение для борьбы с вредителями и улучшения сельскохозяйственных культур.

Ген MATI был выбран в качестве потенциального кандидата, участвующего в защите от T. urticae на основании его высоких уровней экспрессии в устойчивом образце Bla-2 Arabidopsis после заражения клещами по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в восприимчивом образце Kon (Журов и др., 2014). Наши результаты подтверждают и подтверждают широкую роль белка MATI в защите растений от травоядных на основании: (i) паутинного клеща T. urticae вызывает больше повреждений листьев при нокдауне Col- mati , чем при избыточной экспрессии Col- MATI растения и подавление MATI улучшает продуктивность клещей; (ii) растения Kon- MATI способны частично реверсировать чувствительный фенотип образца Kon против нападения паутинного клеща и; (iii) личинки чешуекрылых S.exigua хуже растут на линиях со сверхэкспрессией Col- MATI и потребляет меньше ткани листа, чем на нокаутированных линиях mati или WT. Соответственно, предыдущие транскриптомные исследования показали индукцию MATI у травоядных животных Pieris rapae (Coolen et al., 2016). MATI принадлежит к семейству белков с неизвестной функцией, высоко консервативным среди видов покрытосеменных, что позволяет предположить потенциальную роль этого белка против нападения травоядных у многих видов. К сожалению, отсутствие какого-либо домена с известной функцией в его последовательности затрудняло расшифровку молекулярной функции этого небольшого белка.Чтобы разобраться с его биологической функцией, были проведены анализы Co-IP для выявления предполагаемых белковых взаимодействующих. Предполагается, что белки, принадлежащие к биологическому комплексу, должны иметь связанные молекулярные функции, должны располагаться в одном и том же клеточном компартменте и должны участвовать в общем физиологическом процессе (Zhang et al., 2008). Результаты показали, что белок MATI может участвовать в сложной сети, поскольку классификация предполагаемых интеракторов на биологические категории выделила связанные физиологические процессы, такие как фотосинтез, окислительно-восстановительные пути, окислительно-восстановительный гомеостаз, метаболизм серы и образование метаболитов-предшественников.Таким образом, защитная роль MATI, по-видимому, участвует в любом аспекте окислительно-восстановительного метаболизма и, вероятно, связана с буферизацией тиоловых групп белка против чрезмерного окисления. Эта предполагаемая физиологическая роль может быть легко интегрирована в реакцию растения на T. urticae .

В целом, начальное взаимодействие растение-травоядное запускает пути передачи сигнала, которые обычно включают сигнализацию Ca ²⁺, продукцию ROS, каскады фосфорилирования и события регуляции транскрипции, ведущие к специфическим защитным ответам (Wu and Baldwin, 2010; War et al. ., 2012). Защитные реакции начинаются, когда травоядные животные взаимодействуют с растением путем введения элиситоров и запуска сигнальных молекул растительного происхождения (Zebelo and Maffei, 2015). Первым последствием в растительной клетке является появление изменений в потоках ионов, в основном Ca ²⁺, связанных с изменениями полярности плазматической мембраны, ведущими к EL. Утечка электролита практически мгновенно обнаруживается после воздействия стресса и обычно сопровождается накоплением АФК (Демидчик и др., 2014). АФК считаются важными компонентами передачи сигналов вредителям, включая паутинных клещей (Leitner et al., 2005; Santamaria et al., 2012a). Избыточный окислительный стресс, вызванный H ₂ O ₂, и сильная деполяризация плазматической мембраны в конечном итоге приводят к запрограммированной гибели клеток. Напротив, умеренные концентрации H ₂ O ₂ и деполяризация плазматической мембраны могут по-разному воспринимать передачу защитных сигналов (Foyer and Noctor, 2005; Bailey-Serres and Mittler, 2006; Baxter et al., 2014). Тиоловые группы участвуют в снижении окислительного стресса, контролируя неблагоприятные эффекты на выживаемость клеток, оказываемые АФК. Наши результаты показывают, что после заражения клещами листья растений Col- mati и WT показали сильное увеличение уровней H ₂ O ₂ и утечку электролита вместе с резким снижением накопления тиоловых групп, вероятно, связанных с к гибели клеток, которой способствует кормление акари. Напротив, заражение растений со сверхэкспрессией MATI не приводит к увеличению электролитической утечки и вызывает умеренное накопление H ₂ O ₂.Таким образом, манипуляции с антиоксидантным статусом растений должны свидетельствовать о явном влиянии на продуктивность травоядных и последующие защитные фенотипы растений. Согласно этой гипотезе, мутанты Arabidopsis pad2-1 (с дефицитом глутатиона) или мутанты vtc1-1 (с дефицитом аскорбиновой кислоты) оказались более восприимчивыми к Spodoptera littoralis , чем контрольные линии (Schlaeppi et al., 2008). Таким образом, мы можем утверждать, что ген MATI так или иначе участвует в регуляции окислительно-восстановительного статуса клетки, опосредованной H ₂ O ₂ и тиоловыми группами, чтобы защитить клетку от чрезмерного окисления и облегчить активацию защитной сигнализации. пути.

Обширная характеристика взаимодействий между растениями и вредителями также продемонстрировала интеграцию между АФК и гормональной передачей сигналов в защите растений (Kerchev et al., 2012b; Mur et al., 2013). Режим питания травоядного животного и растения-хозяина определяет участие фитогормонов, которые, по-видимому, модулируют тонкую настройку защиты в ответ на каждый вид травоядных. Как правило, жасмонаты связаны с активацией защитных реакций по отношению к широкому кругу травоядных насекомых (Howe and Jander, 2008; Wu and Baldwin, 2010).Аналогичным образом, JA-индукция защиты растений от паутинных клещей была широко описана (Li et al., 2002, 2004; Ament et al., 2004; Schweighofer et al., 2007; Zheng et al., 2007; Zhang et al. , 2009; Журов и др., 2014; Martel et al., 2015; Diaz-Riquelme et al., 2016). У Arabidopsis Журов с соавт. (2014) сообщили о ключевой роли JA в создании эффективной защиты от клещей с использованием мутантов, дефектных по биосинтезу JA ( aos ) и регулируемой JA транскрипции ( myc ), которые показали повышенную чувствительность к T.крапивница приступ. Как и ожидалось, мы обнаружили, что биологически активные молекулы жасмоната JA и JA-Ile накапливались через 24 часа заражения клещами во всех протестированных генотипах, но с очень сильным накоплением в линиях со сверхэкспрессией Col- MATI . Эти результаты связывают окислительно-восстановительный баланс с присутствием JA-регулируемых соединений и вовлекают ген MATI в окончательную модуляцию обеих функций. Теперь вопрос в том, как MATI влияет на сигнальный путь JA. У Arabidopsis защита растений от травоядных по-разному регулируется двумя разными ветвями пути передачи сигналов JA, которые антагонистически контролируются факторами транскрипции MYC2 и ORA59.Специализированное травоядное насекомое P. rapae индуцирует экспрессию MYC2 и маркерного гена ветви MYC2 VSP2 и подавляет транскрипцию ORA59 и маркерного гена JA / этиленовой ветви PDF1.2 (Verhage et al., 2011; Вос и др., 2013). Наши результаты показывают сверхэкспрессию генов, участвующих в продукции предшественника JA OPDA и регулируемого JA чувствительного гена VSP2 , сопутствующее незначительной индукции PDF1.2 в растениях Col- MATI либо через 1 час, либо через 24 часа заражения. Эти находки могут быть интерпретированы как регулируемое MATI предпочтение MYC2-ветви против ORA59-ветви. С другой стороны, продукция JA и JA-Ile растениями Arabidopsis Col-0 также увеличивалась после нападения жевательного насекомого S. exigua (Rehrig et al., 2014). Наши результаты с S. exigua предполагают, что накопление JA, опосредованное геном MATI , также придавало устойчивости этому жевательному насекомому, расширяя его потенциальную роль в качестве ключевого защитного модулятора.Эти результаты коррелируют с наблюдаемыми более высокими уровнями JA и JA-Ile у растений с избыточной экспрессией MATI , подтверждая, что JA является функциональным продуктом защиты Arabidopsis, регулируемой MATI , и предполагая, что MATI выполняет свою функцию выше в ветви MYC2. сигнального пути JA.

Однако ответ травоядных не означает единственную активацию сигнального пути JA. Другие гормоны индуцируются при питании при специфическом взаимодействии растений и насекомых (Nguyen et al., 2016) на основе молекулярных паттернов, связанных с травоядными животными (Acevedo et al., 2015; Xu et al., 2015). Крайний случай представлен многими насекомыми, питающимися флоэмами, которые в основном вызывают накопление СК в растении (Foyer et al., 2016). Точная настройка защитных реакций растений на конкретных атакующих может быть достигнута за счет перекрестного взаимодействия между JA и другими фитогормонами (Erb et al., 2012; Pieterse et al., 2012).

Антагонистический эффект перекрестных помех между путями передачи сигналов JA и SA был исследован на молекулярном уровне в контексте устойчивости растений к травоядным животным (Kawazu et al., 2012; Thaler et al., 2012; Вос и др., 2015). Этот антагонизм использовался травоядными для подавления JA-опосредованной защиты. Напр., Белокрылка Bemisia tabaci индуцирует накопление SA в Arabidopsis, которая играет ключевую роль в подавлении эффективной защиты JA растения-хозяина, расположенного ниже по ходу передачи сигналов JA, повышая производительность белокрылки (Zhang et al., 2013). Несмотря на этот функциональный антагонизм, существует несколько примеров взаимодействий между растениями и травоядными, приводящих к одновременному накоплению JA и SA (Diezel et al., 2009; Чунг и др., 2013; Zhang et al., 2013). Содержание СК также увеличивается в томатах и арабидопсисе в ответ на заражение паутинным клещом (Kant et al., 2004; Glas et al., 2014; Журов и др., 2014). Значимость накопления СК может зависеть от конкретного взаимодействия растения и травоядных, поскольку в транскрипционной реакции растений томата и арабидопсиса на T. urticae были обнаружены глубокие расхождения (Журов и др., 2014; Martel et al., 2015). ) и в реакции томата на разные т.urticae (Alba et al., 2015). У томатов накопление СК было связано с более высокой защитной ролью против T. urticae (Kant et al., 2004, 2008; Villarroel et al., 2016). Напротив, зараженные паутинным клещом растения Arabidopsis, дефицитные по биосинтезу SA или последующей передаче сигналов, существенно не изменяли повреждение растений или продуктивность клещей (Zhurov et al., 2014). Поскольку индукция SA может препятствовать JA-индуцированным ответам, накопление SA, вызванное паутинным клещом у Arabidopsis, может быть стратегией, направленной на минимизацию точных защитных реакций растений.Сигнальные эффекты, вызванные MATI, также участвуют в модуляции уровней SA. MATI растения со сверхэкспрессией постоянно накапливают СК, что может быть связано с более высокой базальной устойчивостью этих растений против вредителей / патогенов, уязвимых для защиты, индуцированной СК. После кормления паутинным клещом, в то время как у растений WT и Col- mati накопление СК, вероятно, сильно возрастает как механизм, запускаемый клещом, чтобы помешать правильному защитному ответу, концентрация СК в растениях со сверхэкспрессией MATI снижалась, что приводило к реакции для оптимизации функциональности пути передачи сигналов JA.

Передача сигналов

ABA связана с устойчивостью растений к травоядным животным посредством взаимодействия передачи сигналов JA (Dinh et al., 2013; Vos et al., 2013). Обычно это взаимодействие способствует более высокой защите, но Hillwig et al. (2016) продемонстрировали, что дефицит ABA увеличивает защитные реакции против тли Myzus persicae , которая индуцирует сигнальный путь SA. Содержание АБК увеличивалось в нокдаун-линиях mati после заражения клещами, но не изменялось в растениях Col- MATI или WT.Эти результаты предполагают остаточную роль этого гормона в защитном ответе против T. urticae . Влияние на накопление АБК в растениях Col- mati могло быть связано с широким перепрограммированием гормональных сигнальных путей, связанных с отсутствием белка MATI.

Членистоногие-фитофаги явно влияют на метаболизм растений, ограничивая ресурсы для роста и развития в пользу защиты растений (Huot et al., 2014). Классическая реакция растений на травоядных включает уменьшение фотосинтеза, закрытие устьиц, усиление дыхания и изменения окислительно-восстановительного состояния клеток, а также другие изменения (Керчев и др., 2012а, б; Baxter et al., 2014). Как и ожидалось, снижение уровней пигмента было обнаружено в зараженных линиях Col- mati и WT, связанное с повреждением, наблюдаемым в листьях Arabidopsis. Напротив, хотя листья линий Col- MATI также были повреждены после кормления клещами, они имели тенденцию накапливать хлорофилл и каротиноиды. Интересно, что анализ данных экспрессии гена MATI в GENEVESTIGATOR свидетельствует о сильном подавлении этого гена, когда растения подвергаются воздействию темноты, связывая MATI со способностью клетки накапливать фотосинтетические пигменты.Эти результаты предполагают, что репрограммирование клеток, осуществляемое MATI , связано с минимизацией компромиссов между защитой растений и ростом.

Взяв все данные вместе, предлагается рабочая модель белка MATI для защиты от паутинных клещей (рис. 8). Наши результаты предполагают, что MATI кодирует белок, участвующий в накоплении восстановителей при атаке паутинного клеща, чтобы контролировать окислительно-восстановительный гомеостаз растений, избегая чрезмерного окислительного повреждения. Кроме того, MATI вызывает сигнальные эффекты, которые модулируют различные гормональные сигнальные пути, влияя на экспрессию генов, участвующих в биосинтезе и передаче сигналов гормонов JA и SA.Как следствие, MATI обеспечивает высокую устойчивость растений к паутинным клещам, снижая повреждение листьев и плодовитость клещей. Будущие эксперименты будут выполнены, чтобы объяснить точную роль белка MATI в этой чрезвычайно скоординированной модуляции сигнальных путей и проанализировать, участвует ли MATI в защите от других вредителей и патогенов. Кроме того, то, как MATI участвует в модуляции уровней фотосинтетических пигментов, является ключевым вопросом для рассмотрения возможности использования белков MATI в качестве биотехнологических инструментов.

РИСУНОК 8. Предлагаемая рабочая модель белка MATI в защите растений от атаки T. urticae . Белок MATI способствует накоплению антиоксидантов в ответ на питание паутинного клеща, контролируя окислительно-восстановительный гомеостаз растений, чтобы избежать окислительного повреждения и гибели клеток (PCD). Кроме того, MATI участвует в модуляции сигнальных путей гормонов JA и SA, в конечном итоге вызывая эффекты JA. Как следствие, MATI вызывает у растений устойчивость к паутинным клещам, уменьшая повреждение листьев и снижая плодовитость клещей.

Взносы авторов

ID, VG и MM выступили инициаторами исследования. MS выполнил большую часть экспериментальных исследований. FO и AA участвовали в тестах питания насекомых. ID, MM, VG и MS участвовали в разработке, сборе, анализе или интерпретации данных для работы. Все авторы внесли свой вклад в окончательную версию рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана проектами Министерства экономики и конкуренции Испании (проекты BIO2014-53508-R и 618105-FACCE-Era Net Plus) и правительства Канады через Genome Canada и Институт геномики Онтарио (OGI – 046). Исследовательский фонд Онтарио (RE08-067) и Совет по естественным и инженерным исследованиям Канады.М.С. был получателем постдокторского гранта Министерства экономики и конкуренции Испании (подпрограмма Juan de la Cierva 2012).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Пабло Гонсалеса-Меленди (CBGP-UPM-INIA) за его поддержку в конфокальном микроскопе и доктораПьеру Рузу (VIB-Ghent University) за советы по биоинформатическому анализу.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2017.00975/full#supplementary-material

Сноски

https://abrc.osu.edu/
http://arabidopsis.info/
http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
http: // bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
http://www.arabidopsis.org/
http://pfam.xfam.org/
http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/
http://www.greenphyl.org
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle
http://www.phylogeny.fr
http://www.megasoftware.net/
http://skylign.org/
http: // www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html
http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/
http://string-db.org/
https://imagej.nih.gov/ij/
https://genevestigator.com/gv/

Список литературы

Асеведо, Ф. Э., Ривера-Вега, Л. Дж., Чанг, С. Х., Рэй, С., и Фелтон, Г. У. (2015). Сигналы от жевательных насекомых — пересечение DAMP, HAMP, MAMP и эффекторов. Curr. Opin. Plant Biol. 26, 80–86. DOI: 10.1016 / j.pbi.2015.05.029