Разное

Мембранная парка: Парка мембранная мужская ONI в магазине «ONIspb» на Ламбада-маркете

зимняя мембранная парка

Размер 128+6

Замеры:

длина парки 66

ширина парки по подмышкам 44

рукав от шеи 63

Размер 134+6

Замеры:

длина парки 67

ширина парки по подмышкам 45

рукав от шеи 66

Размер 140+6

Замеры:

длина парки 69

ширина парки по подмышкам 46

рукав от шеи 69

Размер 146+6

Замеры:

длина парки 71

ширина парки по подмышкам 48

рукав от шеи 71

Размер 152+6

Замеры:

длина парки 73

ширина парки по подмышкам 49

рукав от шеи 74

Размер 158+6

Замеры:

длина парки 76

ширина парки по подмышкам 50

рукав от шеи 76

Стильная зимняя мембранная парка High Experience выполнена из высокотехнологичных материалов и в стиле современных тенденций моды, отлично сидит по фигуре. Идеальна для ритма городской жизни. Девочкам отлично подойдет для школы. Удачное сочетание материалов надежно защитят в морозную погоду. Стиль Casual.

Водоотталкивающая мембрана 1000010000. Утеплитель Thermolite plus. Отстегивающийся регулируемый капюшон, регулируемые манжеты, полная защита от всевозможных погодных условий при необходимом комфорте. Отличная модель для занятия зимними видами спорта и прогулок.

  • Материал: 100% полиэстер;
  • Верхняя ткань: 100% нейлон;
  • Мембрана: Водонепроницаемость — 10000мм, паропроницаемость — 10000г/м2/24ч;
  • Утеплитель: Thermolite plus — плотность -280 гр. равномерно распределен по всей площади парки. Подклад — гладкий полиэстер.
  • Температурный режим от 0 до -35 градусов;
  • Отстегивающийся капюшон с подкладкой, отстегивающийся натуральный мех на капюшоне;
  • Технологичная скользкая подкладка в рукавах;
  • Регулируемые манжеты рукавов на липучке;
  • Внутрення утягивающая кулиска по талии для придания приталенного силуэта
  • Большое количество карманов на молнии с облегченным скольжением;
  • Внутренний горизонтальный карман на молнии;
  • Родина Бренда — Канада;

Женская мембранная куртка парка 8848 Altitude Passion blanc

ДОСТАВКА НА ВСЕ СЛУЧАИ ЖИЗНИ

У нас вы можете выбрать подходящий способ доставки: 1. курьером домой или офис 2. в пункт самовывоза 3. доставка до почтового отделения 4. забрать заказ в нашем магазине. В Москве срок доставки 1 день. Вы всегда можете выбрать удобную для вас дату и диапазон времени доставки. Живете за пределами Москвы? Это не страшно — мы готовы доставить ваш заказ по Подмосковью, а также во все города России! При этом получить заказ вы сможете уже в течение 2-5 дней. 

УДОБНАЯ И БЕЗОПАСНАЯ ОПЛАТА

Оплачивайте картой, наличными или в момент получения заказа. У нас доступно множество вариантов оплаты и Вы точно найдете тот, которым привыкли пользоваться: Оплата картой онлайн, перевод Сбербанк-Онлайн, Яндекс.Деньги, Qiwi кошелек, квитанцией в банке, карта Тинькофф, наложенный платеж в почтовом отделении и оплата наличными. Безопасность платежей с помощью банковских карт обеспечивается технологиями защищенного соединения HTTPS и двухфакторной аутентификации пользователя 3D Secure. 

ОБМЕН И ВОЗВРАТ БЕЗ ПРОБЛЕМ

Покупка должна доставлять удовольствие, а не проблемы. Мы это отлично понимаем. Если товар не подошел, не понравился, позвоните нам по бесплатному номеру 8 (800) 550-98-68 и мы подберем удобный Вам способ обмена или возврата. В нашем интернет-магазине Вы можете сделать это в течение 30 дней с момента получения заказа. 

КОНСУЛЬТАЦИЯ ЭКСПЕРТОВ

В нашем интернет-магазине работают люди только со спортивным прошлым. Два мастера спорта, КМС и любители. Мы сами использовали и используем в своих тренировках товар нашего магазина. Сможем не понаслышке рассказать о нем и помочь в выборе. 

ПОДБЕРЕМ НУЖНЫЙ РАЗМЕР 

Если сомневаетесь в размере, мы поможем выбрать. В большинстве случаев для определения размера достаточно веса и роста. Если не сможем точно определить какой всё-таки размер верный, то отправим два разных размера, чтобы вы смогли померить и выбрать подошедший. Такая услуга доступна для всех крупных и районных городов, где присутсвует компания СДЭК.

ГАРАНТИЯ ЛУЧШЕЙ ЦЕНЫ

Нашли товар дешевле в другом магазине? Мы продадим его по такой же цене. Всего несколько условий: магазин должен быть действующим и в наличии должен быть товар такого же размера. Акция Не суммируется с другими скидками и акциями. Для заказа по сниженной цене пришлите нам ссылку в онлайн чат, на почту или в обратную связь, либо напишите в комментарии к заказу при оформлении. Мы пересчитаем заказ. 

 

Парка мембранная водоотталкиваюащая утепленная Швеция Tenson Lester Grey

Водонепроницаемая мужская куртка Lester от высокотехнологичного шведского бренда Tenson — это удобная и стильная мужская куртка из модельного ряда шведского бренда, которая отлично справляется с непогодой и осадками.

Tenson с 1951 года ориентирован на сохранение Вашего комфорта и практичности своих изделий в самых суровых погодных условиях в независимости от того, где Вы находитесь и чем занимаетесь — будьте уверены, продукция идеально подойдет для активных занятий спортом и городской жизни.

Технология MPC (Quality 4226)- влагостойкость, ветронепроницаемость и в то же время комфортная циркуляция воздуха гарантированы

Технология Dermizax — это водонепроницаемая мембрана с высокоэффективной непористой структурой, обеспечивающей максимальную воздухопроницаемость

Power comfort — это мягкая оболочка из флиса, используется как изолирующий второй слой для эффективного испарения влаги при потоотделении, создавая изолирующий воздушный «карман», который сохраняет тепло и сухость

AIRPUSH — собственный материал бренда Tenson, обеспечивающий превосходную воздухопроницаемость и комфорт, где бы Вы ни находились и чем бы ни занимались. Плотность на 20-30% выше обычных материалов — мелкие поры испаряют внутреннюю влагу, при этом предотвращая проникновение воды снаружи

Применение технологии Taped Seams — обработка швов термо-пластической лентой под высоким давлением — запечатывает швы, тем самым препятствуя проникновению влаги внутрь куртки, дополнительно обеспечивая вашему телу сухость и комфорт

Водонепроницаемость: 10 000 мм водяного столба

Паропроводность: 10 000 гр/м2/24 часа

Рекомендуемый температурный режим: от +10 до -10 градусов

Особенности модели:

—Модель — классическая парка

Центральная застежка на молнии и кнопках c дополнительными липучками

—Высокопрочная «тракторная» пластиковая молния легко выполняет свою функцию в любую непогоду

—Большой, удобный и теплый регулируемый капюшон

Эргономичная система карманов

—2 верхних кармана на молниях удобны для рук или хранения мелких вещей

—2 нижних кармана на кнопках

—Манжеты рукавов регулируются кнопками

—Регулируемый объем талии

—Вышитый логотип Tenson на груди

—Логотип MPC на левом рукаве

—Высококачественная фурнитура YKK

—Тиснение названия бренда на кнопках парки

—Состав: внешний — 100% полиамид подкладка — 100% полиэстер, утеплитель — 100% полиэстер внутренняя флисовая подкладка карманов

—Крепкие капроновые швы

Рекомендации по уходу:

—Стирка при температуре 40 градусов

—Первый раз стирайте отдельно от других вещей

—Запрещено: отбеливать, гладить и отжимать в стиральной машине

—Разрешено сушить при низкой температуре

—Разрешена химическая чистка сухими реагентами

—Сделано в Китае

Параметры модели: рост — 183 см, вес ~ 78 кг, объем груди — 110 см, бедра 97 см рукав — 53 см плечи — 47 см Размер М«

Уважаемые покупатели!
Наш интернет-магазин сохраняет для Вас право обменять Вашу покупку, в товарном виде, в течение 30 дней от дня доставки или сделать возврат денежных средств, по любой причине, в течение 14 дней.
Подробнее.

Мембранная парка Tortuga ProLine — куртка 3 в 1 для спорта

Флагманская линейка PRO LINE — всесезонная стильная и технологичная. Парка является незаменимой экипировкой для профессиональных спортсменов и любителей спорта. А также она подходит для активных людей, которые любят путешествовать и отдыхать за городом.

Надевая TORTUGA, вы будете ощущать себя комфортно даже в сильнейший шторм, ливень и холод, благодаря ее конструктивным особенностям.

Мягкая быстросохнущая подкладка

Влагозащитные внешние карманы

Капюшон с высокой стойкой

Прокленные швы для влагозащиты

Только в ProLine

Трехслойная мембрана 10000/10000

Только в ProLine

Прорезиненные молнии на карманах

Только в ProLine

Вентиляционные молнии на груди

Удлинённая мембранная Куртка-Парка Женская 8848 Altitude Derica Red 223203

Мнение SKIRUNNER: Женская Куртка-Парка 8848 Altitude Derica — это Ветро и водонепроницаемая удлинённая Парка с утиным пухом. Самый теплый выбор на зиму. 

Этот удлинённый пуховик — безусловный хит бренда 8848 каждую зиму! Ежегодно Шведы его перевыпускают в том или ином цвете. Традиционно это самая теплая городская куртка фирмы 8848 Altitude на самую суровою зиму до -35-40 градусов! Идеальна для длительных прогулок на морозе, например с ребёнком.

В ней Вы гарантированно не замерзните даже в самые лютые морозы. А стильный дизайн будет выделять Вас среди окружающих. Благодаря использованию мощной горнолыжной мембраны DurAtec® Extreme, парка не продувается ветром иполностью защищена от дождя и мокрого снега. Парка идёт удлинённого кроя, что тоже добавляет тепла.  

Мех на капюшоне закрывает лицо от погодных условий, меховая отделка может быть снята. Здесь также есть высокий воротник. Посадка легко адаптируется под вашу фигуру с помощью шнурков на талии и подоле. Основная молния открывается в две стороны, поэтому парку удобно растегивать даже сидя.

Женский слегка приталенный крой, высококачесвенные материалы и функциональные мелочи делают парку идеальным вариантом верхней одежды на осень и зиму для длительных прогулок на морозе.

  Юрий Масный — Мастер Спорта по спортивному ориентированию на лыжах и бегом.

Удлинённая мембранная Куртка-Парка Женская 8848 Altitude Derica Red предназначена для:

  1. Длительных прогулок на морозе, например с ребёнком.
  2. На каждый день на зиму, в том числе и в плохую погоду: дождь, ветер, снег
  3. Активного отдыха зимой

Внимание! Куртка большемерка на 1 размер. Лучше заказывать на 1 размер меньше чем по таблице размеров и чем вы обычно носите.

 Характеристики: Мембранная Куртка-Парка Женская 8848 Altitude Passion (223203)
Бренд 8848 Altitude — Швеция
Мембрана durAtec Extreme
Водонепроницаемость (WP) 10000 мм
Воздухопроницаемость (MP) 6-8000 гр/м2/24 ч
Материал

Наружний материал / мембрана: durAtec Extreme
Основной материал: 100 % нейлон Oxlan Наполнитель 300 гр, fp 650 (90% пух, 10% перо)

Температурный режим 

0°..-35°С

Крой
Более классический прямой крой, 
слегка приталенный
(Regular Fit)
Цвет  Красный

Особенности 

  • Мембрана DurAtec Extreme
  • Ветро и влагозащита (Windproof-and Water-reppelent)
  • Повышенные дышащие свойства ткани
  • Полностью проклеенные швы
  • Утеплитель – синтетических пух премиум качества
  • Водонепроницаемые молнии YKK, расстегивающиеся в 2 стороны
  • Регулируемый капюшон
  • Отстегивающийся мех на капюшоне
  • Утяжка внизу куртки
  • Утяжка на талии
  • Утяжка внизу рукава, лайкровые манжеты
  • Карманы на рукаве, по бокам– всего 2 внешних кармана
  • Боковые карманы утеплены мягким флисом внутри
  • Внутренний карман
  • Отделка пушистым искусственным мехом

Мембрана DURATEC® Extreme — 10.000 мм 
  • DurAtec® Extreme- это мембрана,  ламинированием нанесенная на изнаночную сторону ткани. 
  • Влагозащита  > 10 м ( мембрана выдерживает постоянное давление 10 м воды на 1 м ткани при  специальном тестировании) 
  • DurAtec® Extreme- ветрозащита
  • DurAtec® Extreme- ” дышащие свойства” 10 000 гр/м2/24 ч ( способна постоянно выводить 10 000 грамм воды на 1 метр ткани в течение 24 часов).
  • DurAtec® Extreme  — все швы  проклеены,  это означает,  что одежда обладает  полностью водонепроницаемыми свойствами.

В Краснодарском крае на 20 февраля зарегистрировано 3437 болеющих COVID-19 | ОБЩЕСТВО

В Краснодарском крае на 20 февраля зарегистрировано 3437 болеющих COVID-19, коронавирус подтвердился у 1243 мужчин и 2194 женщин в возрасте до 95 лет, 220 пациентов – несовершеннолетние, сообщает оперативный штаб региона.

В Краснодаре выявили 1167 случаев заражения, в Новороссийске – 204, в Сочи – 202, в Тихорецком районе – 163. В Туапсинском районе положительный тест получили 110 человек, в Тимашевском – 106, в Динском – 101, в Абинском – 97. В Кореновском районе выявили 87 заболевших, в Крымском – 83, в Горячем Ключе – 81, в Усть-Лабинском районе – 79. В Славянском районе прибавилось 77 пациентов, в Анапе – 75, в Северском районе – 67, в Красноармейском и Выселковском районах – по 53, в Курганинском и Ленинградском – по 50. В Армавире коронавирусную инфекцию обнаружили у 48 жителей, в Геленджике – у 46, в Кавказском районе – у 45, в Каневском – у 42. В Ейском и Калининском районах по 36 новых случаев, в Приморско-Ахтарском – 31, в Мостовском и Темрюкском – по 28, в Брюховецком – 25, в Лабинском – 23. По 22 жителя заболело в Белоглинском, Отрадненском, Павловском и Тбилисском районах. В Гулькевичском районе 19 инфицированных, в Кущевском – 14, в Крыловском – 13. По три случая зафиксировали в Белореченском и Новопокровском районах, два – в Староминском, по одному – в Новокубанском и Щербиновском.

С начала пандемии на Кубани коронавирус подтвердился у 206978 человек. Показатель заболеваемости на 100 тысяч населения достиг 3641.

За весь период выздоровели 145854 жителя, в том числе за последние сутки –4469. Скончались 10290 заболевших.

На дому с подозрением на коронавирус лечится 51388 кубанцев, у 47766 из них диагноз лабораторно подтвержден. В стационарах находятся 5811 человек, в том числе 3068 – с подтвержденным COVID-19.

По информации краевого министерства здравоохранения, в тяжелом состоянии на искусственной вентиляции легких 110 пациентов, еще пять – на экстракорпоральной мембранной оксигенации.

В медорганизации Кубани с подозрением на коронавирус за весь период обратились 828770 граждан. Лаборатории провели 6507358 исследований, в том числе 16869 – за последние сутки.

В Краснодарском крае за сутки 4326 человек заболели коронавирусом

На 17 февраля коронавирус подтвердился у 1758 мужчин и 2568 женщин в возрасте до 102 лет. Из них – 290 пациентов несовершеннолетних, сообщает министерство здравоохранения Краснодарского края.

В Новороссийске – 394, в Тихорецком районе – 222, в Сочи – 236. В Брюховецком районе зафиксировали 177 случаев заболевания, в Северском – 135, в Динском – 134, в Тимашевском – 125, в Анапе – 124. В Усть-Лабинском районе — у 108 человек, в Белореченском – у 105, в Кореновском – у 99, в Туапсинском – у 98. В Гулькевичском районе подтвердился 81 случай, в Геленджике – 78, в Курганинском районе – 76, в Славянском – 68, в Ейском и Кавказском – по 65. В Армавире инфекцию обнаружили у 60 жителей, в Каневском районе – 57, в Абинском – 54, в Крымском – 53.

В Горячем Ключе 50 новых заразившихся пациентов, в Темрюкском районе – 44, в Крыловском – 34, в Отрадненском – 43, в Успенском – 39. В Апшеронском, Калининском и Красноармейском районах по 31 заболевшему. На один человек меньше с ковидом выявили в Лабинском районе, 27 – в Ленинградском, 25 – в Выселковском, 21 – в Мостовском. В Новокубанском районе 19 случаев, в Кущевском – 16, в Тбилисском – 12, в Павловском – 9. В Приморско-Ахтарском районе прибавилось 7 пациентов, в Белоглинском – 6, в Новопокровском – 3, в Староминском и Щербиновском – по 2 человека.

С начала пандемии на Кубани коронавирус подтвердился у 195880 человек. Показатель заболеваемости на 100 тысяч населения достиг 3446.

За весь период выздоровели 130476 жителей, в том числе за последние сутки 6820. Скончались за весь период 10252 заболевших.

На амбулаторном лечении с подозрением на коронавирус находится 55280 кубанцев, у 51968 из них диагноз на дому подтвержден. На стационарном лечении находятся 5808 человек, из них 3184 – с подтвержденным диагнозом COVID-19.

В тяжелом состоянии на искусственной вентиляции легких 112 пациентов, еще пять – на экстракорпоральной мембранной оксигенации, рассказали в краевом министерстве здравоохранения.

В медорганизации Кубани с подозрением на коронавирус за весь период обратились 812332 человека. Лаборатории провели 6452933 исследования, в том числе 21168 – за последние сутки.

Елизавета Ушань

Новости на Блoкнoт-Краснодар

Куртка от дождя с мембраной | Touratech: Интернет-магазин аксессуаров для мотоциклов

Куртка от дождя с мембраной | Touratech: Интернет-магазин аксессуаров для мотоциклов

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Так же низко, как €74,91

Номер детали

01-500-2340-0П

вкл. 0% налог

Классический, практичный, хороший!
Этот плащ поставляется без новомодных излишествами, но с функциональными деталями, просто выполняющими свое назначение: защита от дождя и холода.Кроме того, дышащая мембрана защищает от перегрева и потливости летом. Капот, встроенный в воротник, предотвращает проникновение воды между шлемом и воротник куртки.
В сочетании с брюками от дождя это идеальная комбинация, которая бросит вызов любой погоде!

Внешний материал: 100 % полиамид, подкладка 100 % полиэстер

Свойства/свойства:
— Водонепроницаемая и дышащая мембрана
— Капюшон, встроенный в воротник куртки
— Эластичная лента на бедрах
— Эластичный шнур в шве куртки
— Эластичные застежки-липучки на рукавах
— Светоотражающий материал на верхней части туловища и руках
— Передняя молния с застежкой-липучкой
— Один внутренний карман за застежкой-липучкой
— Хорошая видимость через неоново-желтый цвет на верхней части туловища и предплечьях
— YKK молнии

В настоящее время нет доступных загрузок.

{{/thumbnail_url}} {{{_highlightResult.name.value}}}

{{#categories_without_path}} в {{{categories_without_path}}} {{/categories_without_path}} {{#_highlightResult.color}} {{#_highlightResult.color.value}} {{#categories_without_path}} | {{/categories_without_path}} Цвет: {{{_highlightResult.цвет.значение}}} {{/_highlightResult.color.value}} {{/_highlightResult.color}}

{{price.EUR.default_formated}} {{#price.EUR.default_original_formated}} {{price.EUR.default_original_formated}} {{/price.EUR.default_original_formated}} {{#цена.EUR.default_tier_formated}} От {{price.EUR.default_tier_formated}} {{/price.EUR.default_tier_formated}}

Copyright © 2020. Все права защищены.

Мембранная куртка Superdry Run — мужские куртки и пальто

БЕСПЛАТНЫЙ возврат в Великобритании

Пожалуйста, верните нам ваши товары вместе с заполненной формой возврата в течение 28 дней с момента доставки.Вы также можете вернуть товар во все магазины Великобритании. Пожалуйста, убедитесь, что товары находятся в их первоначальном состоянии.

Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с нашей политикой возврата.

Обратите внимание: из соображений гигиены мы не можем предложить обмен или возврат нижнего белья/купальников/косметики, если они не запечатаны в оригинальной упаковке.Это не влияет на ваши законные права.

БЕСПЛАТНЫЙ возврат в Великобритании
Пожалуйста, верните нам ваши товары вместе с заполненной формой возврата в течение 28 дней с момента доставки.Вы также можете вернуть товар во все магазины Великобритании. Пожалуйста, убедитесь, что товары находятся в их первоначальном состоянии.
Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с нашей политикой возврата.

Обратите внимание: из соображений гигиены мы не можем предложить обмен или возврат нижнего белья/купальников/косметики, если они не запечатаны в оригинальной упаковке.Это не влияет на ваши законные права.

мембранное пальто |

сингапурский доллар

Аннотации


Создано вручную

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, с помощью раскрывающегося списка, расположенного под таблицей, или используйте страницу прокрутите вверху справа таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца сортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Ген/Комплекс Классификатор Генная онтология Термин Аспект Расширение аннотации Доказательства Метод Источник Назначено Артикул

Высокопроизводительный

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, с помощью раскрывающегося списка, расположенного под таблицей, или используйте страницу прокрутите вверху справа таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца сортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Ген/Комплекс Классификатор Генная онтология Термин Аспект Расширение аннотации Доказательства Метод Источник Назначено Артикул

Вычислительный

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, с помощью раскрывающегося списка, расположенного под таблицей, или используйте страницу прокрутите вверху справа таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца сортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Ген/Комплекс Классификатор Генная онтология Термин Аспект Расширение аннотации Доказательства Метод Источник Назначено Артикул

Структура транспортно-везикулярной оболочки COPII, собранная на мембранах

1) Неясно, какое значение следует придавать внутренней решетке Sec23/24-Sar1.Эти белки переносятся на мембрану негидролизуемым GppNHp, что приводит к их двукратному превышению по сравнению с Sec13/31. Авторы описывают заманчивые особенности этого регулярного массива: электростатическую комплементарность контактов решетки, точное соответствие смоделированного Sec22 SNARE, упаковку пептидного элемента Sec24 на Sec23. Но все это может быть сродни описанию решетки белкового кристалла. Необходимо дальнейшее обсуждение этого вопроса, чтобы прояснить, что обширная регулярность может быть особенностью сборки in vitro.Напр., авт. могут рассмотреть, до какой степени груз с заметной цитоплазматической массой может вписаться в эти тубулярные регионы, если они покрыты такой плотно упакованной решеткой Sec23/24-Sar1 .

Рецензенты справедливо отмечают, что наблюдаемая нами обширная регулярная решетка может быть сродни 2D-кристаллу, которому способствует отсутствие гидролиза GTP, и требуют дальнейшего обсуждения этого вопроса. Пересмотренная рукопись теперь включает приведенный ниже текст.

В разделе «Структура внутреннего слоя» старт:

«Мы не можем исключить, что крупномасштабный порядок, наблюдаемый во внутренней решетке оболочки, способствует сборке in vitro в отсутствие гидролиза GTP…»

В разделе «Взаимосвязь между внутренним и внешним покрытием и значение для сборки», начиная с:

«Пробелы и дислокации как во внутренней, так и во внешней решетках покрытия могут дополнительно способствовать изменчивости кривизны…»

Один из рецензентов поднял в этой связи небольшой вопрос.Предложенное объяснение того, чем отличается решетка Sec13/31 на трубках и сферах, не кажется вполне окончательным. (Углы альфа и бета уместны, но упоминание о них, как правило, сбивает с толку, а не решает проблему). В простейшем смысле расширенная решетка возникает из-за того, что стержни Sec13/31 могут собираться в массив квадратов (ромбоидов). Расположение стержней +/+ и -/- не обязательно для образования ромбовидной решетки; расположение +/- будет работать, оно сохранит двойные центры вершин.Скорее, важность расположения +/+ -/- предположительно заключается в том, что эта геометрия приводит решетку Sec13/31 в близкое (хотя все еще несовершенное) соответствие с внутренней решеткой Sec23/24-Sar1. Что касается этого момента, неясно, насколько непрерывным на самом деле является расположение +/+ -/- вдоль канальцевых мембран. В Таблице Рисунок 3 — дополнение к рисунку 3 разница между краями ячеек для левой (31,9 нм) и правой (30,2 нм) «спиралей» кажется несколько небольшой.Было бы полезно, если бы авторы могли измерить это на основе кристаллической структуры Sec13/31. Могли ли действительно быть случайные дислокации в +/+ -/- решетке ?

Рецензенты предполагают, что разница между краями +/+ и -/- (17 Å) кажется немного небольшой. Мы измерили ожидаемую разницу, основанную на кристаллической структуре кубооктаэдрической клетки, и обнаружили, что она составляет примерно 40Å. Это измерение не учитывает, что изменения угла при вершине или выпрямление стержней могут изменить разницу в длине.Тем не менее, разница между длинами стержней действительно меньше ожидаемой. Мы включили сравнение с кристаллической структурой.

Тот факт, что разница меньше, чем ожидалось, может, как предполагают рецензенты, быть результатом дислокаций в решетке (теперь мы прямо сообщаем об этом в рукописи: « Зазоры и дислокации как во внутренней, так и во внешней решетках покрытия могут вносить дополнительный вклад в изменчивость кривизны «). Рецензенты правы в том, что расположение +/- также может собрать ромбовидную решетку, но для этого потребуется, во-первых, чтобы вершина могла деформироваться до такой степени, что углы альфа и бета равны, и, во-вторых, чтобы она могла быть ориентирована в двух направлениях, повернутых на девяносто градусов. положения относительно основной кривизны поверхности трубы.Напротив, расположение +/+, -/- позволяет формировать ромбовидную решетку, сохраняя при этом меньший угол альфа и больший угол бета во всех вершинах. Проще говоря, сборка ромбовидной решетки на поверхности трубы по схеме +/- потребовала бы более существенной деформации вершины. В исходной заявке дополнение содержало раздел об оценке расположения наружного покрова, где описаны наблюдения, указывающие преимущественно на расположение «+/+» и «-/-».Мы отредактировали этот раздел (см. цитату выше). Далее, мы разъяснили этот вопрос в основном тексте.

Мы также включили дополнительную панель в рис. 3 — дополнение к рисунку 2 с легендой:

«Ромбовидная решетка может иметь две формы. В первом случае каждая вершина будет иметь одинаковую ориентацию относительно трубы (левая панель)…»

2) Трубчатые варианты круглых структур были одними из самых ранних структур оболочки, когда-либо изученных с помощью электронной микроскопии — полиголовки Т4 и родственных бактериофагов, подробно изученных Келленбергером и Клугом в 60-х годах.Эти группы изучили различные классы полиголовок и предложили, как их может генерировать упаковка субъединиц. Напомним также, что Т-четные фаги на самом деле имеют удлиненные головы (из-за «талии» между двумя закругленными концами, каждый из которых имеет гемиикосаэдрическую симметрию), а гигантские фаги Т4 имеют очень длинные головы (вытянутые трубчатые перетяжки). Совсем недавно прекрасная работа Сандквиста и Финча о конусообразных сборках капсидного белка ВИЧ-1 иллюстрирует еще более поразительный полиморфизм, который приводит к образованию конусообразных трубочек.Так что неоправданное употребление в конце первого абзаца в «Результатах и ​​обсуждении» слова «неожиданно» (междометие, которое в научных публикациях следует употреблять скупо, если вообще употреблять) — это либо признание в неведении, либо ненужная попытка придать «новизну». Если проколлаген и другие удлиненные молекулы транспортируются по пути COPII, то тубулярные структуры с закругленными концами — это именно то, что мы можем ожидать. Представленные здесь структурные результаты интересны не тем, что они показывают трубки с полусферическими концами, а скорее тем, что структура трубок не единственная, которую можно было бы представить из решетки изометрических покрытий, и тем, что решетка имеет убедительную интерпретацию в с точки зрения структур высокого разрешения его компонентов.Авторы должны добавить некоторое обсуждение четких и соответствующих прецедентов для их результатов .

Мы писали: «Неожиданно внутренний слой покрытия тоже оказался в виде регулярного массива». Для нас это было действительно неожиданно, но мы понимаем, что это слово опрометчиво, и удалили его.

Мы благодарим рецензентов за предложение сравнить, как структурная гибкость решетки COPII соотносится с предыдущей работой над удлиненными головками фагов и массивами CA ВИЧ. В соответствии с просьбой мы добавили в рукопись обсуждение этих систем.

3) Авторам следует обратить внимание на понятие квазиэквивалентности и на то, каким образом структуры икосаэдрических вирусов с высоким разрешением дали этому понятию конкретные воплощения и модифицировали более ранние формулировки. Авторы, по-видимому, не понимают, что существует важный прецедент в работе над вирусными структурами, особенно классические исследования Клуга, которые последовали за первоначальной работой над полиголовками. Различные конформации краев (шарнирный изгиб) вполне согласуются с аналогичными вариациями в сборках и полиморфизмах вирусных капсидов.В этом отношении описание ребер как «++», «+-» и т. д. сбивает с толку. Обозначения, основанные на контактах на концах, а не на конформации самого краевого димера, могут ввести читателя в заблуждение, заставив его думать, что димеру присуща некоторая внутренняя асимметрия, а не асимметрия его связывания (которая может вызывать, а может и не вызывать). некоторая дальнодействующая асимметрия в его конформации) .

Добавлено сравнение структур вируса (см. ответ на предыдущий пункт).

Мы принимаем во внимание риск того, что читатель может быть сбит с толку двусмысленностью между асимметрией связывания и присущей асимметрией димерам Sec13/31.Мы считаем целесообразным принять те же обозначения «+» и «-», которые использовались в предыдущей литературе для описания контактов на концах стержней, и считаем, что краткие обозначения «+/-» для описания стержней предпочтительнее, чем введение более длинных фраз, таких как «стержни, имеющие контакт + на одном конце и контакт — на другом конце». Чтобы свести к минимуму риск путаницы, мы отредактировали текст в двух ключевых позициях:

.

A) «В клетках, собранных in vitro, каждый стержень Sec13/31 образует контакт «+» на одном конце и контакт «-» на другом конце.

B) «Вместе эти данные подразумевают, что три свойства способствуют приспособляемости внешнего слоя…»

4) Модель в конце кажется двум рецензентам маловероятной или ненужной. Упаковка удлиненного груза может привести к переключению с полусферической формы на трубчатую, точно так же, как некоторые изменения натяжения мембраны или другие стохастические флуктуации, по-видимому, привели к переключению во время сборки изучаемых здесь оболочек in vitro. Более того, нет никаких причин, по которым белки внешнего и внутреннего слоев не могут собираться вместе, при этом решетка последнего накладывает регулярность на упаковку первого.Выявление регуляторных белков, которые каким-то образом взаимодействуют с грузом, может отправить клеточных биологов на ненужную погоню за дикими гусями. В случае удлиненных фаговых головок внутренний белок (скаффолд), по-видимому, определяет формирование трубчатой ​​части: это действительно похоже на груз в случае везикулы. (ДНК фага встраивается позже, после того, как каркас исчезает.) Обратите внимание, что пример белка оболочки, который, по-видимому, не образует трубчатых структур (т. е. решетки, изогнутые в одном направлении, но не в другом, вместо решеток с двумя измерениями кривизны) является клатрином, вероятно, потому, что он изогнут в тройственной вершине, которая может уплощаться (более или менее), но не только в одном направлении.В этом случае удлиненные грузы вызывают остановку сборки покрытия, потому что оболочка изгибается назад к мембране, окружающей груз, и не может продолжаться; рекрутирование актина затем вызывает дальнейшее поглощение 90–182 .

Мы согласны с рецензентами в том, что грузовая упаковка может привести к переходу от сферической к трубчатой ​​морфологии и что внутреннее и внешнее покрытия могут собираться вместе, при этом внутреннее покрытие придает регулярность внешнему покрытию, или наоборот. Мы сожалеем о недоразумении: целью нашей модели не было постулировать регуляторные белки, которые взаимодействуют с грузом.Это предположение на самом деле уже распространено в литературе COPII, и белки-кандидаты уже идентифицированы. Например, «… определенные белки могут контролировать загрузку больших грузов и соответственно регулировать размер носителей COPII… Недавние открытия показали, что белки TANGO1 и cTAGE5 собираются в димер в местах выхода ER и что оба необходимы для секреции коллагена VII. . TANGO1 связывает коллаген VII, а TANGO и cTAGE5 связывают белки COPII Sec23/24… Таким образом, TANGO1 и его партнеры по связыванию являются отличными кандидатами в качестве факторов, которые могут задерживать гидролиз Sar1-GTP в зависимости от груза, путем связывания Sec23/Sec24 и задержки рекрутирования комплекс Sec13/Sec31.Таким образом, TANGO могут способствовать расширенному росту носителей COPII». (Malhotra and Erlmann, EMBO J., 2011) и «… был достигнут значительный прогресс в идентификации рецепторов, таких как TANGO1, которые направляют упаковку ПК в транспортные носители COPII… В нашей рабочей гипотезе совместное действие TANGO1 и Sedlin координирует стабилизация внутреннего слоя COPII (через TANGO1) с эффективным циклированием Sar1 (через Sedlin) для предотвращения преждевременного сужения мембраны, что позволяет рост зарождающихся носителей и включение крупных префибрилл PC…» (Venditti et al., Наука, 2012). Наша модель была предназначена для размещения наших данных в контексте этой существующей литературы. Учитывая, что наши данные имеют отношение к обширному существующему обсуждению модуляции размера несущей, мы считаем целесообразным продолжить некоторое обсуждение этого вопроса в документе. Принимая во внимание опасения рецензентов, мы отредактировали последний абзац обсуждения, а также легенду к рисунку 7B.

Мы надеемся, что эта новая формулировка модели является полезным вкладом и не рискует отправить кого-либо в погоню за дикими гусями.

5) Наконец, есть некоторые технические аспекты криоэлектронной томографии, на которые следует обратить внимание авторам. Информация о подобъемном усреднении минимальна, поэтому оценить качество данных не представляется возможным. Не помешало бы несколько репрезентативных томограмм реальных данных. Кроме того, использование коррекции CTF недостаточно хорошо поддерживается. Авторам необходимо показать спектры мощности без коррекции CTF, чтобы показать наличие измеримого сигнала за первым нулем (для данных в рис. 4 ).При 200 кВ и расфокусировке около 2 микрон первое пересечение нуля CTF составляет около 22,5 Å, поэтому заявление об улучшении разрешения с коррекцией CTF трудно понять. Фактическое разрешение, вероятно, составляет около 30 Å, несмотря на графики FSC, которые особенно ненадежны для определения разрешения в средних субтомограммах. Тем не менее, механистические выводы можно было бы сделать, даже если бы данные были только при разрешении 30-40 Å .

Все структуры, все соответствия и репрезентативная томограмма из исходных данных были депонированы в EMDB/PDB.

Диапазон расфокусировки, описанный в разделе обработки данных для близких к фокусу данных (1,5–2,5 мкм), относится к номинальной расфокусировке при сборе данных, в то время как измеренная дефокусировка набора данных находится в диапазоне 2,0–3,2 мкм. Приносим свои извинения за двусмысленность, которая уже исправлена.

Это помещает первый узел среднего CTF данных примерно на 27 Å, что означает, что для получения разрешения 20 Å требуется коррекция CTF.

Теперь мы добавили раздел в Методы и дополнительный рисунок, содержащий подтверждение важности и успешности коррекции CTF: мы взяли окончательную реконструкцию внутреннего слоя по данным с поправкой на CTF и без поправки на CTF и сравнили ее с объемным генерируется из выстроенной кристаллической структуры комплекса Sec23/24/Sar1.КФС между рентгеновской структурой и скорректированной ЭМ структурой показывают положительную корреляцию с разрешением ~20 Å, тогда как КФС между рентгеновской структурой и нескорректированной ЭМ структурой показывает инверсию фазы примерно при 27 Å, как и ожидалось. Это включено в рисунок 4 — дополнение к рисунку 1, которое также включает визуализацию карты в сравнении с упорядоченными кристаллическими структурами, отфильтрованными до разрешения реконструкции путем умножения с FSC.

Отметим, что разрешение карты было измерено с использованием подхода «золотого стандарта» (две половины набора данных обрабатывались совершенно независимо на всех этапах, а при выравнивании применялся фильтр нижних частот на 45 Å).Кроме того, маска, используемая для измерения разрешения (которая действительно может способствовать переоценке разрешения), была осторожной: сфера с гауссовской диаграммой в пять пикселей падала. Мы разъяснили это в тексте.

Мы добавили текст, поясняющий подход к измерению расфокусировки, когда мы не использовали спектры мощности изображения.

Хотя мы согласны с рецензентом в том, что те же выводы можно было бы сделать, если бы мы получили структуру с более низким разрешением, тем не менее, мы должны включить нашу наилучшую оценку правильного разрешения.По причинам, изложенным выше, мы уверены как в поправке CTF, так и в оценке разрешения. В пересмотренном основном тексте мы теперь используем значение критерия 0,5, равное 23 Å.

https://doi.org/10.7554/eLife.00951.018

Усреднение субтомограмм сборок COPII показывает, как организация оболочки определяет форму мембраны pFASTBacHTb для разделов 23/24 и 13/31.Все используемые здесь праймеры приведены в дополнительной таблице 1.

Экспрессия и очистка Sar1

N-концевая His-меченая конструкция Sar1 была экспрессирована в клетках BL21 E. coli (Star™ DE3; Invitrogen) и аффинно очищена путем связывания с колонкой HisTrap (GE Healthcare) в буфере A (50 мМ TRIS-буфера с 150 мМ NaCl, 0,1 % Tween-20 (об./об.), 10 мМ имидазола, 1 мМ DTT, pH 8,0) и элюирования имидазолом. градиент. Расщепление His-меченой протеазы TEV (соотношение протеазы:Sar1 ~1:50 (вес/вес)) проводили в течение ночи при диализе против буфера А.Вторую колонку HisTrap использовали для удержания TEV и расщепления 6His, а Sar1 в проточном потоке концентрировали с использованием центробежного фильтра MWCO 10 кДа до 0,85 мг/мл (~38,6 мкМ), готового к использованию в реакциях почкования.

Экспрессия и очистка Sec23/24

Один литр клеток насекомых Sf9 (при 1 × 10 6 клеток/мл) инфицировали 9 мл бакуловируса, содержащего бакмиду с немеченым Sec23, и 3 мл His-меченого Sec24 вирус. Клетки собирали и лизировали через 3 дня.Гетеродимеры Sec23–Sec24 подвергали аффинной очистке путем связывания с колонкой HisTrap в буфере для лизиса (20 мМ HEPES, 250 мМ сорбита, 500 мМ ацетата калия, 10 мМ имидазола, 10 % глицерина и 1 мМ DTT, pH 8,0) и элюирования имидазольный градиент. Фракции, содержащие Sec23–Sec24, разбавляли примерно вдвое в низкосолевом буфере (20 мМ Трис, 1 мМ ацетат магния, 0,1 мМ EGTA и 1 мМ DTT, pH 7,5) перед загрузкой на анионообменную колонку (HiTrap Q; GE Healthcare). Комплекс элюировали градиентом NaCl и разбавляли до конечной концентрации ~1.26 мг/мл (~6,6 мкМ) с буфером с низким содержанием солей плюс 10% глицерина перед мгновенной заморозкой и хранением при –80 °C.

Экспрессия и очистка Sec13/31

Один литр клеток насекомых Sf9 (при 1 × 10 6 клеток/мл) инфицировали 9 мл немеченого вируса Sec13 и 3 мл His-меченого вируса Sec31 либо при N- или С-конец. HisTrap и анионный обмен выполняли, как описано в разделе 23/24. Отдельные замороженные аликвоты подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex200 объемом 2,4 мл (GE Healthcare), уравновешенной буфером для реакции почкования (20 мМ HEPES, 50 мМ KOAc и 1.2  мМ MgCl 2 , pH 6,8) перед использованием в реакциях почкования. Концентрацию пика гель-фильтрации измеряли перед каждой реакцией почкования.

Для получения Sec13/31 без метки после элюции HisTrap был применен дополнительный этап расщепления протеазой TEV 1:25 (вес/вес) с последующим ночным диализом против буфера А. Вторую колонку HisTrap использовали для сохранения TEV и расщепления 6His и Sec13-Sec31 в проточном режиме наносили на анионообменную колонку, замораживали и аликвоты подвергали гель-фильтрации, как описано выше.

Штаммы и плазмиды дрожжей

Штаммы выращивали при 30 °C в стандартном YPAD (дрожжевой экстракт 11 г/л, пептон 22 г/л, глюкоза 20 г/л, аденинсульфат 55 мг/л, дополненный 100 мг /л ноурсеотрицина (Jena Bioscience) при необходимости) или синтетической полной среды (6,7 г/л азотистого основания дрожжей, 20 г/л глюкозы, дополненной аминокислотами по мере необходимости). При выращивании на чашках добавляли 25  г/л агара. Чашки 5-FOA содержали 6,7 г/л азотистого основания дрожжей, 20 г/л глюкозы, 0,7 г/л синтетической добавки к среде для отсева (Sigma-Aldrich), 50 г/л урацила, 20 г/л агара и 1 г /л 5-FOA (Sigma).Для анализа роста штамм LMY1249 с делецией SEC31 ( sec31::NAT pep4::TRP ade2-1 his3-11 leu2-3,112  + [pYCp50:: SEC31-URA3 ]) трансформировали плазмидами1 дикого типа18 SEC31 или sec31-Nhis , и способность каждой формы Sec31 поддерживать рост тестировали путем серийного разведения на среде, содержащей 5-FOA, для контрселекции плазмиды SEC31::URA дикого типа.

Связывание с липосомами

Липиды Major-Minor Mix 21 высушивали до липидной пленки в роторном испарителе и регидратировали до 2 мМ буфера HKM (20 мМ HEPES pH 6.8; 160 мМ КОАс; 1  мМ MgCl 2 ) при комнатной температуре путем периодического встряхивания. Затем ресуспендированные липиды 13 раз экструдировали через поликарбонатный фильтр с размером пор 400 нм. Семьдесят пять мкл реакций связывания включали липиды и очищенные компоненты COPII в буфере HKM до следующих конечных концентраций: 0,27 мМ липосомы, 15 мкг/мл Sar1, 20 мкг/мл Sec23/24, 30 мкг/мл Sec13/31 и 0,1 мМ. Нуклеотид. Реакции инкубировали в течение 30 мин при 25°С. Пятьдесят микролитров реакционного объема смешивали с равным объемом 2.5 M Sucrose-HKM, наложенные на 100 µl 0,75 M Sucrose-HKM и 20 µl HKM. Градиенты вращали в роторе Beckman TLA-100 (100 000 об/мин, 20 мин, 25°С). Верхние 20 мкл градиента собирали, разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и визуализировали с помощью SYPRO Red.

Микромозные азазы

микромальные мембраны микромасных мембран (1 мг) промывали 3 × 1 мл 2,5 м мочевины-B88 (20 мм HEPES, pH 6,8, 150 мм KOAC, 250 мм сорбит, 5 мм мг (OAC) 2 ) и 3 ×1 мл B88 (15 000 об/мин, 2 мин, 4 °C).Реакции почкования были созданы в B88, включая 10 мкг/мл Sar1, 10 мкг/мл Sec23/24, 20 мкг/мл Sec13/31, 0,1 мМ нуклеотида и смеси для регенерации АТФ (конечные концентрации: 1 мМ АТФ, 50 мкМ GDP- маннозы, 40 мМ креатинфосфата, 200 мкг/мл креатинфосфокиназы в B88) и инкубировали (30 мин, 25 °С). Отбирали 12 мкл общей реакции и отделяли везикулы от донорских мембран центрифугированием (15 000 об/мин, 2 мин, 4°С). Везикулы собирали центрифугированием 200 мкл супернатанта (50 000 об/мин, 25 мин, 4°С).Супернатант удаляли, а осажденные везикулы ресуспендировали в буфере для образцов SDS и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблотинга с антителами α-Sec22 и α-Erv46. Поликлональные антитела кролика были получены против GST-слияния растворимого цитоплазматического домена Sec22 и Erv46 соответственно. Полный иммуноблот, использованный на рис. 1d, представлен на дополнительном рисунке 7. Реакции почкования

GUV

GUV были получены путем электроформирования смеси основных и второстепенных липидов в концентрации 10  мг/мл в смеси хлороформ/метанол 2:1 13 .Вкратце, смесь липидов распределяли по двум предметным стеклам из оксида индия и олова (ITO), которые соединяли между собой силиконовой прокладкой, образуя камеру. Камеру наполняли 300 мМ сахарозы перед подачей переменного напряжения 10 Гц и 3 В (среднеквадратичное значение) в течение 6–8 ч с использованием медной ленты. GUV собирали путем аспирации сахарозы из камеры и нанесения на 300 мМ глюкозы при 4 °C в течение ночи.

Размер и морфологию GUV качественно оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Scope A.1 с объективом Zeiss Plan-Apochromat ×63 (1.4 Масло ДВС). Почкование восстанавливали путем добавления белков COPII в определенных концентрациях (1 мкМ Sar1, 320 нМ Sec23/24, 173 нМ Sec13/31), 1 мМ GMP-PNP, 2,5 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 10% (об./об.) GUV в буфер реакции почкования до общего объема 30 мкл. Реакции осторожно встряхивали для перемешивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 1–3 часов.

Подготовка образцов для ЭМ

Для крио-ЭМ 8 мкл золотых реперных образцов размером 5 нм (растворы BBI) добавляли к 30 мкл реакционной смеси для почкования непосредственно перед витрификацией.Четыре микролитра реакции почкования наносили на сетчатые углеродные сетки с отрицательным тлеющим разрядом (Agar Scientific, 200 Mesh Copper, S166) и подвергали глубокой заморозке с использованием системы FEI Vitrobot, поддерживаемой при 4 °C и 100% влажности. Сетки хранились в жидком азоте до использования в ЭМ.

Для отрицательного окрашивания 4 мкл реакции почкования наносили на непрерывную углеродную пленку с отрицательным тлеющим разрядом, 300 меш, медные сетки (EM Sciences, CF300-Cu) и окрашивали 2% ацетатом уранила в соответствии со стандартными процедурами.Сетки просматривали на собственных электронных микроскопах T10 или T12 (Tecnai 100 и 120 kV соответственно), оснащенных ПЗС-камерами.

Сбор данных криоэлектронной томографии

В результате реакций почкования с Sec31-Nhis было получено большее количество гомогенных пробирок по сравнению с теми, которые переносились с Sec31 дикого типа, что обеспечивает идеальный образец для определения структуры с высоким разрешением. Набор данных томографии реакций почкования Sec31-Nhis был собран в крио-ЭМ-центре Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) в Гейдельберге на FEI Titan Krios, работающем на 300 кВ.Данные собирались автоматически с использованием энергетического фильтра Gatan Quantum с детектором K2 xp (Gatan, Плезантон, Калифорния) в режиме EFTEM и щелью 20 эВ. Размер пикселя составлял 1,327 Å, расфокусировка колебалась от 1,5 до 3,5 мкм. Схема дозосимметричного наклона 22 , реализованная в SerialEM 23 , использовалась для регистрации наклонов от −60° до 60° с шагом 3° и общей экспозицией ~140 e Å −2 . За один наклон было собрано тринадцать кадров сверхвысокого разрешения, которые на лету подверглись 4-кратному биннингу и выравниванию всего кадра в MotionCor2 (см. 24 ) без компенсации дозы. Выравнивание без комы было выполнено с использованием FEI AutoCTF. Всего за 72-часовой сеанс было собрано 90 томограмм, из которых 83 использовались для усреднения субтомограмм. Томограмма, показанная для конструкции Sec13/31 дикого типа, меченной C-his (рис. 1a), была получена в лаборатории на микроскопе Polara 300 кВ, оснащенном детектором прямых электронов K2, щелью энергетического фильтра при 20 эВ и пиксельным размер 1,433 Å. Сводка по сбору данных приведена в дополнительной таблице 2.

Обработка данных криотомографии

Серии наклона были первоначально выровнены и реконструированы с помощью взвешенной обратной проекции с использованием рабочего процесса IMOD/etomo 25 . Серии наклона с остаточными ошибками, превышающими 1 пиксель, отбрасывались. Томограммы 8X, объединенные в бины, были первоначально реконструированы с помощью 50 итераций фильтрации, подобной SIRT, для начальной проверки, выделения частиц и выравнивания. Несобранные, выровненные ряды наклона были отфильтрованы по дозе с использованием критических значений воздействия, определенных в ссылке. 26 , используя специальные сценарии MATLAB и кумулятивную дозу 2,5 e 2 за наклон.

CTF оценивался с помощью CTFFIND4 (ссылка 27 ) и корректировался во время обратной проекции с использованием конвейера NovaCTF 28 . Мы обнаружили, что оценка расфокусировки становится неустойчивой при больших углах наклона, поэтому для целей оценки мы использовали обрезанные центральные прямоугольные области серии наклонов.

Сбор частиц для усреднения субтомограммы

В описанном рабочем процессе используется комбинация Dynamo 29 и специальных сценариев Matlab.Первоначальный сбор частиц был выполнен, как описано ранее 4 . Вкратце, около 400 000 субтомограмм, отфильтрованных с помощью 8X SIRT, были извлечены из передискретизированных координат на поверхности труб в 32 воксельных ячейках. Начальные углы Эйлера были назначены нормальными к мембране, как определено по оси трубки, отслеживаемой вручную. Для удобства набор данных был вручную разделен на десять пакетов. Среднее значение из первой партии было размазано в направлении большой оси пробирки, чтобы создать невыразительную мембрану и плотность покрытия, используемую в качестве начального эталона для девяти раундов грубого выравнивания.Результат был использован в качестве эталона для начального выравнивания других девяти партий после применения фильтра нижних частот ~ 34 Å. Частицы передискретизации, сходящиеся по одной координате, были удалены с помощью разделения Dynamo по параметру томограммы. Средние значения для каждой пробирки были рассчитаны для определения направления каждой пробирки, и соответственно были скорректированы углы вращения частиц в плоскости. Мы использовали взаимную корреляцию (CC), чтобы исключить плохие частицы из набора данных. Чтобы компенсировать отсутствующие вариации CC, зависящие от клина, мы скорректировали значения CC, используемые для пороговой обработки: для каждой трубки мы эмпирически подобрали полином к графику, описывающему CC в зависимости от угла Эйлера phi, и использовали коэффициенты для взвешивания значений CC.Таким образом, субтомограммы, сгруппированные вокруг золотых шариков или сходящиеся нерегулярными узорами вдали от оси трубки, становились явными выбросами и легко удалялись. Был получен комбинированный набор данных из ~100 000 частиц, который далее был разделен между двумя половинными наборами данных (A и B) для независимой обработки.

Выравнивание и усреднение субтомограмм

C Субтомограммы с поправкой на TF были извлечены и сопоставлены с эталонными фильтрами нижних частот с помощью Dynamo. Итерации проводились, начиная с объединенных данных 8X, с использованием фильтра нижних частот 34 Å, угловой дискретизации 7 ° и допускающих сдвиги 32 Å, а уточнения постепенно улучшались путем уменьшения коэффициента бинирования, с использованием менее жестких фильтров нижних частот. фильтры и более тонкая угловая выборка.Заключительные этапы уточнения были выполнены на несвязанных данных, извлеченных в 224 воксельных блоках, с использованием фильтра нижних частот, установленного на 7,4 Å, угловой дискретизации 1 ° и пределов сдвига 7   Å. После 13 итераций сходимость была достигнута, и уточнения прекратились. Низкочастотная фильтрация на всех итерациях была выбрана на основе кривых FSC между независимыми половинными наборами данных с отсечкой пикселей, установленной при разрешениях ниже, чем указано на пороге FSC 0,5. Во время всех итераций выравнивания использовалась мягкая седлообразная маска шириной в коробку, которая исключала большую часть мембраны и неупорядоченную наружную оболочку.Итоговое среднее значение составило 87 952 субтомограммы (43 484 и 44 468 для каждой половины). Два полусредних значения были взвешены по амплитуде комбинированных CTF. Оценка разрешения с поправкой на маску была проведена в рамках постобработки RELION 30 с использованием маски с мягкими краями вокруг центрального тримера Sec23–Sec24–Sar1 (дополнительный рисунок 2), что дало разрешение 4,87 Å при срезе 0,143 FSC. -выключенный. Оценка локального разрешения и локальная фильтрация применялись с использованием RELION LocalRes с оценкой вручную B -фактора -350.

Фитинг

Рентгеновские структуры Sec23–24 и Sec23–Sar1 (1M2O и 1M2V) были аппроксимированы как твердые тела по плотности для каждого гетеротримера с использованием UCSF Chimera «fit in map» 31 . Затем каждая белковая субъединица была очищена как отдельное твердое тело. Для рис. 4c, d, PDB 2QTV и 2KYW были наложены на подобранную модель, основанную на общей субъединице Sec23, с использованием механизма сопоставления UCSF Chimera.

Для расчета карты различий на рис. 4 каждая субъединица на карте была снабжена соответствующей рентгеновской моделью.Там, где для субъединиц по краям была видна только частичная плотность, модель создавалась на основе спирального расположения соседних субъединиц. Карта была сгенерирована из подобранной модели с использованием химеры UCSF и отфильтрована с помощью фильтра нижних частот до 5 Å. Разница между нормализованной крио-ЭМ картой и картой, полученной с помощью модели, была визуализирована в UCSF Chimera и отфильтрована по Гауссу со стандартным отклонением 3 пикселя. Краткое описание подобранной модели приведено в дополнительной таблице 2.

Доступность кода

Специальные сценарии доступны у соответствующего автора по запросу.

Gene Set — мембранное покрытие

Symbol Имя Стандартизированное значение
AP2S1 связанный с адаптером белковый комплекс 2, субъединица сигма 1 0.663342
COPG2 коатомерный белковый комплекс, субъединица гамма 2 0.663342
SEC31A Гомолог A SEC31 (S. cerevisiae) 0,663342
SEC31B Гомолог SEC31 B (S.cerevisiae) 0,663342
ТИКАМ2 адаптерная молекула толл-подобного рецептора 2 0.663342
КЛТК клатрин, тяжелая цепь (Hc) 0,663342
АП2М1 родственный адаптеру белковый комплекс 2, мю 1 субъединица 0.663342
ВМА21 Гомолог вакуолярной Н+-АТФазы VMA21 (S. cerevisiae) 0.663342
AP2A1 связанный с адаптером белковый комплекс 2, субъединица альфа 1 0.663342
CLTA клатрин, легкая цепь А 0,663342
КОПБ2 белковый комплекс коатомер, субъединица бета 2 (бета прайм) 0.663342
COPZ2 белковый комплекс коатомер, субъединица дзета 2 0.663342
COPZ1 белковый комплекс коатомер, субъединица дзета 1 0.663342
AP5S1 связанный с адаптером белковый комплекс 5, субъединица сигма 1 0.663342
SEC24C Член семьи SEC24 C 0,663342
NCALD нейрокальцин дельта 0.663342
SEC24D Член семьи SEC24 D 0,663342
AP3S1 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица сигма 1 0.663342
AP3S2 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица сигма 2 0.663342
СКИЛ1 SCY1-подобный 1 (S. cerevisiae) 0,663342
АФТФ афтифилин 0.663342
C3ORF58 хромосома 3 открытая рамка считывания 58 0.663342
AP5Z1 связанный с адаптером белковый комплекс 5, субъединица дзета 1 0.663342
AP1G2 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица гамма 2 0.663342
АП5М1 белковый комплекс, родственный адаптеру 5, мю 1 субъединица 0.663342
ТМЕД7 трансмембранный транспортный домен белка emp24, содержащий 7 0.663342
AP1S1 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица сигма 1 0.663342
COPG1 коатомерный белковый комплекс, субъединица гамма 1 0.237908
AP1G1 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица гамма 1 0.237908
ARCN1 арчейн 1 0,237908
АП3М2 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица мю 2 0.237908
АРЛ6 АДФ-фактор рибозилирования, подобный 6 0,237908
КОПА белковый комплекс коатомера, субъединица альфа 0.237908
NECAP2 Эндоцитоз, связанный с NECAP 2 0,237908
КОПБ1 белковый комплекс коатомер, субъединица бета 1 0.237908
AP2B1 связанный с адаптером белковый комплекс 2, субъединица бета 1 0.237908
ТМЕД3 трансмембранный транспортный домен белка emp24, содержащий 3 0.237908
СИНРГЕТ синергин, гамма 0,237908
CLTB клатрин, легкая цепь В 0.237908
СПРАВИТЬСЯ белковый комплекс коатомер, субъединица эпсилон 0.237908
АП4М1 белковый комплекс, родственный адаптеру 4, мю 1 субъединица 0.237908
AP1S2 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица сигма 2 0.237908
SGIP1 Sh4-домен GRB2-подобный (эндофилин) взаимодействующий белок 1 0.237908
ПАНК1 пантотенаткиназа 1 0,03318
SEC23B Гомолог Sec23 B (S.cerevisiae) 0,03318
ПИКАЛМ белок сборки клатрина, связывающий фосфатидилинозитол 0.03318
ДНМ1 динамин 1 0,03318
AP3B1 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица бета 1 0.03318
STON1-GTF2A1L Чтение STON1-GTF2A1L 0,03318
STON1 стонин 1 0.03318
AP1B1 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица бета 1 0.03318
AP3B2 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица бета 2 0.03318
SEC23A Гомолог A Sec23 (S. cerevisiae) 0,03318
АП1М1 родственный адаптеру белковый комплекс 1, мю 1 субъединица 0.03318
АП1М2 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица мю 2 0.03318
AP4B1 связанный с адаптером белковый комплекс 4, субъединица бета 1 0.03318
IGF2R Рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 0.03318
АП3М1 родственный адаптеру белковый комплекс 3, мю 1 субъединица 0.03318
CLTCL1 клатрин, похожий на тяжелую цепь 1 0,03318
EPS15L1 субстрат пути рецептора эпидермального фактора роста 15-подобный 1 0.03318
DAB2 Dab, митоген-чувствительный фосфопротеин, гомолог 2 (дрозофила) 0.03318
LRRN3 богатый лейцином повтор нейрона 3 0,03318
SNAP91 белок, ассоциированный с синаптосомами, 91 кДа 0.03318
GGA2 связанный с Гольджи, содержащий гамма-адаптин, ARF-связывающий белок 2 0.03318
GGA3 связанный с Гольджи, содержащий гамма-адаптин, ARF-связывающий белок 3 0.03318
СТОН2 стонин 2 0,03318
AP2A2 связанный с адаптером белковый комплекс 2, субъединица альфа 2 0.03318
AP3D1 связанный с адаптером белковый комплекс 3, субъединица дельта 1 0.03318
NECAP1 Эндоцитоз, связанный с NECAP 1 0,03318
SEC24B Член семьи SEC24 B 0.03318
SEC24A Член семьи SEC24 А 0,03318
GTF2A1L общий фактор транскрипции IIA, 1-подобный 0.03318
EPS15 субстрат пути рецептора эпидермального фактора роста 15 0.03318
SCLT1 натриевый канал и клатриновый линкер 1 0.03318
ЭПН2 эпсин 2 0,03318
AP4E1 связанный с адаптером белковый комплекс 4, субъединица эпсилон 1 0.03318
AP1S3 связанный с адаптером белковый комплекс 1, субъединица сигма 3 0.03318
GGA1 связанный с Гольджи, содержащий гамма-адаптин, ARF-связывающий белок 1 0.03318

Эмилия Парка Мембрана Sympatex® Northland Pro MoonStone Trading LLC.

Эмилия Парка Мембрана Sympatex® Northland Pro MoonStone Trading LLC. — Магазин-бутик Northland-Modern Mountain

Бесплатная доставка при заказе на сумму более 75 долларов США по всей территории США.- Вопросы? Позвоните нам 435 315 3450 с 22:00 до 18:00

Логин

Войдите, если у вас есть учетная запись

Регистр

Создав учетную запись в нашем магазине, вы сможете быстрее проходить процесс оформления заказа, хранить несколько адресов, просматривать и отслеживать свои заказы в своей учетной записи и многое другое.

Завести аккаунт

Мембрана Sympatex® 20.000 мм водонепроницаемый 10 000 г/м2/24 часа дышащий ветрозащитный, все швы проклеены, регулируемый и съемный капюшон 2-замковая передняя молния, цвет черный/ пыльно-оливковый 34 — 46 Материал: 100% полиэстер наполнитель: 100% полиэстер Микрофибра fittin

Мембрана Sympatex®

20.000 мм водонепроницаемый

10 000 г/м2/24 часа дышащий

ветрозащитный

все швы проклеены

регулируемый и съемный капюшон

Двусторонняя передняя молния

цвета: черный / пыльно-оливковый

размер: 34 — 46

Материал: 100 % полиэстер, наполнитель: 100 % полиэстер, микрофибра

облегающий фитинг: облегающий

Таблица размеров США

34-ХХС

36-XS

38-С

40-М

42-л

44-XL

46-XXL

 

0 отзыв

0 звезд на основании 0 отзывов

Добавьте свой отзыв

Обзор Эмилия Парка

© Copyright 2022 Northland-Modern Mountain Boutique Shop — Питаться от Скорость света — Тема Гюисманса.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.