Звенигородский ран: Звенигородский | Пансионат с лечением

это история двух друзей детства — Лукаса, 17-летнего ученика шестого класса, и Берта, 19-летнего ученика механика , которые сбежали, чтобы сбежать из своей домашней жизни.

Семейный детский сад в Солнечном городе — Уолнат-Крик, Калифорния 94597

Семейный детский сад в Солнечном городе , стабильно развивающаяся компания, входящая в состав службы по уходу за детьми, управляется Любовью Звенигородской, владельцем Отчета от полного имени.С тех пор их продажи были стабильными и стабильными — от 100 000 до 499 999 долларов. Координаты местонахождения компании: 37.931519, -122.067373.

С ним можно связаться по телефону (925) 947-1215. Полный отчет по телефону , и вы можете связаться с их отделом продаж по адресу 3133 Manor Avenue, Walnut Creek, California CA 94597 . Посетите их веб-сайт: чтобы узнать больше об истории компании, продукции и услуги, а также часто задаваемые вопросы и политику конфиденциальности.

Время от времени также предлагаются специальные предложения. Их профессиональные и честные Деловые операции укрепляют как потребителей, так и предприятия в их сегментах B2C.

В их скромном, но солидном одном месте проживает от 1 до 4 сотрудников. Все пользуются щедрыми программами компании и надежными решениями для обучения.

Вы можете узнать больше, проверив их классификационные коды: SIC — 8351 и NAIC — 6244100.Позвоните по указанной выше горячей линии для более быстрой транзакции и запросов. Детский сад семьи Солнечный город хотел бы получить известие от вас.

игр, которых не было: отмененные и неизданные игры

Включает неизданные и отмененные игры и прототипы как на консолях, так и на компьютерах. Мы — большой архив, посвященный сохранению игр, которые никогда не выпускались для широкой публики. Делитесь историей и историями разработчиков, активами и многим другим, пока не стало слишком поздно.

Некоммерческий проект по оцифровке, направленный на сохранение программного обеспечения и истории в цифровом виде, которые в противном случае были бы потеряны навсегда. Если по какой-либо причине на веб-сайте есть что-то, чего вы не хотите, свяжитесь с нами для удаления.

Crimetown Depths

1989 Imageworks

Платформа: Amiga

Очень короткая запись для названия, уже описанного на Amiga GTW, где вы можете найти скриншоты и бегущую демонстрацию для загрузки, а также ответы на вопросы создателя Паоло Костабель.

Когда игра стала слишком амбициозной и должна была заполнить три диска — ей сказали, что она не является финансово жизнеспособной, поэтому игру отменили. К сожалению, на данном этапе о самой игре известно немногое.

Гжегож Антосевич недавно связался с нами, чтобы предоставить редкий экран, показывающий саму игру в действии из журнала Amiga, выпуск 5 1989:

В игре должны были быть элементы платформы / шутера, так что это должен был быть платформер. часть игры.Надеюсь, что что-то из самой игры будет найдено и сохранено, чтобы вы могли увидеть, что могло быть.

Aggression

1994 Bloodhouse / Housemarque

Платформа: Amiga CD32 и Amiga 1200

Спасибо Grzegorz Antosiewicz за заголовок создателей Super Stardust. Aggression должен был быть шутером с горизонтальной прокруткой, графикой с трассировкой лучей и отображением на экране до 512 цветов одновременно.

Должна была быть полноэкранная многоуровневая прокрутка и очень большие спрайты, использующие каждый такт, который могла предложить Amiga.В версии для CD32 была бы лучше анимация и музыка, воспроизводимая непосредственно с компакт-диска.

Игра просто исчезла из виду, и с тех пор о ней никто не слышал. Хотя очень ранняя демоверсия уже вышла и доступна, более поздняя версия с трассировкой лучей еще не появилась в какой-либо форме или форме. Можно ли его когда-нибудь найти и как далеко оно продвинулось?

Галерея

Наемник

1999 Thalamus Interactive

Платформа: Nintendo Color Game Boy

В рамках запуска и выпуска Игры, которых не было книги, мы добавляем ресурсы и контент, которыми мы поделились во время наше исследование в качестве бонусного контента DLC, которое не вошло в книгу.Спасибо Thalamus Digital (Facebook + Twitter) за разрешение разместить это название на сайте.

Mercenary была чрезвычайно популярной игрой для 3D-исследований покойного и великого Пола Вукса, которая породила несколько сиквелов, таких как Damocles и Mercenary 3. Те, кто играл в 8-битные воплощения Mercenary в 1985 году, были поражены скоростью и масштаб игры, и она по праву считается одной из лучших игр, когда-либо украшавших Commodore 64.

Читать далее →

The Speris Legacy — различия между бета-версиями

Спасибо Grzegorz Antosiewicz за хедз-ап за отличный пост о The Speris Legacy от Team 17, в котором показаны различия между ранними демонстрациями и финальной игрой.

Хотя это не неизданная игра, мы иногда пробуем использовать GTW, чтобы продемонстрировать различия между демонстрационными и окончательными версиями, показывая, например, неиспользуемые ресурсы.

Super Adventures In Gaming сделал замечательный анализ с кнопками, которые нужно нажимать, чтобы показать различия между демо и финальной версией. Это отличное чтение, которое стоит проверить!

http://superadventuresingaming.blogspot.com/2020/11/the-speris-legacy-amiga-cd32-part-4.html

Mayhem in Monsterland

1998–2000 Thalamus Interactive

Платформы: ПК и цвет Gameboy

В рамках запуска и выпуска игр, которых не было книги, мы добавляем ресурсы и контент, которыми мы поделились во время наше исследование в качестве бонусного контента DLC, которое не вошло в книгу.Спасибо Thalamus Digital (Facebook + Twitter) за разрешение разместить это название на сайте.

В 1993 году для Commodore 64 наступили тяжелые времена, когда рынок, наконец, начал рушиться вокруг некогда могущественной 8-битной версии. Поскольку каждый месяц выходит лишь небольшое количество игр, и в основном это бюджетные релизы, C64 действительно нужно было хорошо провести время перед его неизбежной коммерческой смертью. С Mayhem в Monsterland (а также с Lemmings, Alien 3 примерно в то же время) нас ни в коем случае не подвели.

Продолжить чтение →

SimMars

2000 Maxis

Платформы: Apple Macintosh и ПК

В рамках запуска и выпуска книги «Игры, которых не было» мы добавляем ресурсы и контент, которые не были » t сделать это для печати в качестве бонусного контента DLC, чтобы поделиться с вами.

В книге содержится углубленный и подробный 12-страничный рассказ о неизданных SimMars от Maxis. Обсуждаем историю разработки с ведущим инженером игрового процесса Джейсоном Шанкелем , системным инженером Алексом Звенигородским , художником и дизайнером Б.Дж. Уэст и ассоциированный продюсер Дэн Брейзелтон , рассказывая об испытаниях и невзгодах, но также о чистом волнении и энтузиазме, которые были в команде, производящей игру.

Читать далее →

Выпущено документальное видео о Green Lantern

В рамках давно запланированного сотрудничества с @Doctor_Cupcakes (он же Лиам Робертсон) теперь вы можете посмотреть его впечатляющее документальное видео о давно утерянной версии Green Lantern для Super Nintendo через DidYouKnowGaming, основанное на исследовании Games Это была не книга и не первая демонстрация беговых кадров игры.

Лиам также связывает игровые сцены с реальными комическими сценами, которые использовались в качестве вдохновения, что было здорово видеть.

Ресурсы Sprite и многое другое также можно найти на нашей странице «Зеленый фонарь», с активами, которые были восстановлены и не были напечатаны.

Новости — Stadie Group | Государственный университет Монтаны

Введение

Область микробной экологии опирается на знания о структуре и составе микробных сообществ в качестве основы для понимания их роли и функций.Независимые от культуры анализы, которые позволяют идентифицировать виды, устойчивые к культивированию, продолжают оказывать большое влияние на наше понимание микробных сообществ с момента первых исследований последовательностей 5S рРНК, проведенных Stahl et al. в середине 1980-х годов [1], [2]. Хотя многие считают, что полноразмерные последовательности, сгенерированные секвенированием по Сэнгеру библиотек клонов 16S рРНК, являются золотым стандартом для филогенетического анализа, даже самые крупные исследования обычно анализируют не более нескольких сотен или тысяч последовательностей для каждого образца из-за дорогостоящих и трудоемких Процесс этот метод влечет за собой [3] — [5].В начале 2000-х годов разработка и коммерческая доступность платформ для высокопроизводительного секвенирования, способных производить от сотен тысяч до миллионов последовательностей за цикл при значительно меньших затратах, чем секвенирование по Сэнгеру, привели к революции в области микробной экологии.

Микробные экологи быстро внедрили высокопроизводительные инструменты пиросеквенирования, производимые Roche 454 Life Sciences, для секвенирования генов 16S рРНК, что привело к открытию того, что было названо «редкой биосферой», и предоставило более глубокое и тщательное представление о составе огромное количество микробных сообществ из самых разных местообитаний [6] — [10].С момента его появления большинство исследователей предпочли пиросеквенирование 454 для проектов микробного разнообразия из-за большей длины считывания, которую предоставляла платформа пиросеквенирования 454 по сравнению с конкурирующими инструментами секвенирования от Illumina и других. Хотя пиросеквенирование 454 способно производить более длинные считывания, чем конкурирующие технологии, оно дает наборы данных, которые демонстрируют характерные ошибки, связанные со вставками / делециями (инделениями) в участках идентичных нуклеотидов (гомополимеры) [11].Эти систематические ошибки должны быть удалены или исправлены с помощью трудоемких и вычислительно-ресурсоемких программных пакетов до дальнейшего анализа [12] — [14].

По сравнению с пиросеквенированием 454, методология секвенирования путем синтеза (SBS) компании Illumina имеет более низкую частоту ошибок на основание и не так подвержена ошибкам с отступом в гомополимерных участках [15], [16]. Значительно более высокое качество последовательностей, генерируемых Illumina, в сочетании с гораздо более низкой стоимостью последовательности по сравнению с пиросеквенированием 454, побудило ряд исследователей разработать стратегии секвенирования ампликонов гена 16S рРНК с использованием систем Illumina [17] — [22].Хотя первоначальные исследования показали, что 16S-секвенирование на основе Illumina дает данные более низкого качества, чем пиросеквенирование 454 [19], корректировки в протоколах подготовки библиотеки и секвенирования позволили получить наборы данных со значительно более высоким качеством, чем пиросеквенирование 454 [18], [22]. В то время как инструменты Illumina исторически генерировали короткие последовательности 30–100 п.н., увеличение максимальной длины чтения на платформе Illumina MiSeq [секвенирование парных концов 2 × 300 п.н. на момент написания этой статьи) позволяет секвенировать ампликоны такой же длины, что и те, которые традиционно используются в 454 исследования пиросеквенирования.Кроме того, длину и качество секвенированных ампликонов Illumina можно увеличить путем выравнивания и объединения каждого набора парных считываний концов в один контиг, процесс, обычно называемый слиянием считывания. Это позволяет исследователям, использующим Illumina MiSeq, создавать объединенные последовательности со средней длиной, аналогичной той, которая была получена при пиросеквенировании 454, но значительно более высокого качества и при более низкой стоимости каждой последовательности [17], [22], [23].

Хотя в некоторых предыдущих исследованиях сравнивались результаты 454 пиросеквенирования и секвенирования Illumina как для метагеномных библиотек, так и для ампликонов 16S [24] — [26], эти исследования в основном были сосредоточены на сравнении показателей бета-разнообразия, чтобы увидеть, дают ли две технологии секвенирования аналогичные сравнения между разные образцы.Таким образом, более тонкие детали относительно того, может ли секвенирование 16S на основе Illumina служить заменой для пользователей, в настоящее время использующих пиросеквенирование 454, еще предстоит полностью изучить. В этом исследовании мы сгенерировали библиотеки ампликонов гипервариабельных областей V4-V5 гена 16S рРНК для 6 естественных микробных сообществ и синтетического фиктивного сообщества, используя те же матричные праймеры гена 16S рРНК, которые были секвенированы с использованием 454 GS FLX или Illumina MiSeq. Кроме того, библиотеки только для гипервариабельной области V4 были созданы и секвенированы на MiSeq с использованием протокола, описанного Caporaso et al.[18] Мы исследовали несколько комбинаций методов обработки данных, включающих кластеризацию OTU и обнаружение химер, чтобы определить комбинацию, которая обеспечивает как эффективность обработки, так и точность. Используя этот метод обработки, мы проанализировали полученные наборы данных и сравнили результаты анализов альфа- и бета-разнообразия, чтобы оценить, привел ли выбор платформы секвенирования к значительным различиям, которые могут повлиять на интерпретацию результатов.

Мы выбрали для анализа пять образцов, представляющих различные микробные сообщества, ассоциированные с хозяином: стул взрослого человека (образец человека), содержимое кишечника медицинской пиявки Hirudo verbana (образец пиявки), содержимое малого кишечник здоровой мыши (образец Mouse), неприлипающую микробную фракцию, полученную из содержимого рубца молочной коровы (образец Rumen), и содержимое задней кишки восточного подземного термитника Reticulitermes flavipes (образец Termite).Смешанный щелок из муниципальных очистных сооружений сточных вод, расположенных на территории Университета Коннектикута, кампус Сторрс (образец сточных вод), был включен в состав сложного, разнообразного микробного сообщества окружающей среды. Мы также включили синтетическое фиктивное сообщество (образец Mock), которое было разработано Human Microbiome Project (HMP) и включает следующие 20 видов бактерий в равной концентрации в соответствии с количеством копий рибосом: Acinetobacter baumannii str. 5377, Actinomyces odontolyticus str.1A.21, Bacillus cereus str. NRS 248, Bacteroides vulgatus str. NCTC 11154, Clostridium beijerinckii str. NCIMB 8052, Deinococcus radiodurans str. R1 (гладкий), Enterococcus faecalis str. ОГ1РФ, ул. Escherichia coli К12 подл. MG1655, ул. Helicobacter pylori. 26695, ул. Lactobacillus gasseri 63 AM, Listeria monocytogenes str. EGDe, Neisseria meningitidis str. MC58, Propionibacterium acnes str. KPA171202, Pseudomonas aeruginosa str. PAO1-LAC, Rhodobacter sphaeroides str. ATH 2.4.1, Staphylococcus aureus TCh2516, Staphylococcus epidermidis FDA str.PCI 1200, Streptococcus agalactiae str. 2603 В / Р, Streptococcus mutans str. UA159 и Streptococcus pneumoniae str. ТИГР4. Для библиотеки 454 использовалась более ранняя версия фиктивного сообщества HMP, которое включало те же 20 видов плюс Porphyromonas gingivalis str. 2561. Протокол RBB + C, описанный Yu и Morrison [27], был использован для выделения высококачественной геномной ДНК из всех образцов, кроме стула человека и ложного сообщества. Мнимая ДНК сообщества была получена от BEI Resources (номер по каталогу HM-276D, Геномная ДНК от Microbial Mock Community B, даже в концентрации).

Винсент Янг (Мичиганский университет) щедро предоставил ДНК человеческого стула от анонимной женщины-донора. Комитет IRB Университета Коннектикута (UConn) определил, что наше исследование не требует одобрения IRB для использования нами этого образца, поскольку он был ранее собран в соответствии с утвержденным протоколом IRB, и донор дал согласие на его использование в последующих исследованиях, таких как наше. Образцы рубца и мыши были собраны в рамках одобренных IACUC исследований, проводимых в Университете Коннектикута, которые не являются частью настоящего исследования.Комитет UConn IACUC определил, что это исследование не требует отдельного утверждения для использования этих образцов, поскольку они были собраны в соответствии с утвержденными протоколами как часть текущих исследовательских программ, а не по конкретному запросу авторов. Пиявки были приобретены у Leeches USA, утвержденный поставщик медицинских пиявок и термитов был приобретен у CT Valley Biological Supply. Для взятия пробы сточных вод не требовалось никаких специальных разрешений или разрешений.

Мы использовали праймеры, ранее разработанные для амплификации гипервариабельных областей V4-V5 гена 16S рРНК для создания библиотек 454 и Illumina с использованием конструкций гибридных праймеров, подходящих для соответствующих платформ секвенирования (таблица 1) [28].Последовательность связывания матрицы 16S была идентична для обоих наборов праймеров слияния, с праймерами слияния 454 в соответствии со стандартным форматом, используемым Морской биологической лабораторией (MBL), и праймерами слияния Illumina с использованием формата, описанного Bartram et al. [17]. Библиотеки для всех семи образцов были подготовлены и секвенированы путем пиросеквенирования 454 в Центре Джозефин Бэй Пол в MBL в соответствии со стандартными протоколами на GS FLX с использованием химии титанового секвенирования [28].

Для всех наборов праймеров последовательности, специфичные для матрицы 16S, выделены жирным шрифтом.Для праймеров 454 Xs в прямом направлении представляют ключ прогона 5 п.н., определенный MBL, с подчеркнутой частью, представляющей последовательность адаптера 454 Lib A (прямой праймер) или Lib B (обратные праймеры). Подчеркнутые части праймеров Illumina представляют полную последовательность адаптера TruSeq (праймеры V4-V5) или усеченную версию (V4). N-основания, выделенные курсивом для праймеров V4-V5, представляют неоднозначную смесь из 4 оснований между последовательностью адаптера TruSeq и последовательностью матрицы 16S. Xs в прямом праймере V4-V5 представляют собой последовательность одного из 6-ти п.н. индексов TruSeq, определенных Illumina, тогда как в прямом праймере V4 они представляют 12-п.н. кодирующий штрих-код Голея, как определено Caporaso et al.

Все библиотеки секвенирования Illumina были подготовлены и секвенированы в Университете Коннектикута. Мы подготовили два набора библиотек V4-V5 Illumina для шести образцов естественного сообщества в два разных периода времени. Первый набор библиотек был подготовлен по тому же протоколу, что и для 454 библиотек пиросеквенирования, с продуктом ПЦР для каждого образца геля, очищенным перед объединением и секвенированием. Продукты ПЦР для второго набора библиотек V4-V5 Illumina и фиктивных общественных библиотек очищали с использованием модуля 0.6-кратный объем ПЦР магнитных шариков AMPure XP в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, мы подготовили библиотеки для гипервариабельной области V4 в соответствии с протоколом, описанным Caporaso et al. [18]. Библиотеки Illumina секвенировали в отдельных прогонах MiSeq с использованием протокола парных концов 2 × 250 п.н.

Наборы данных пиросеквенирования V4-V5 454 были предварительно обработаны перед анализом QIIME в соответствии с внутренним конвейером обработки, используемым MBL для анализа пиросеквенирования 454.Последовательности должны были иметь полный индекс и последовательность прямого праймера без ошибок ни в одном из них, иметь нулевые неоднозначные основания по всей длине считывания и быть длиннее 300 п.н. после обрезки последовательностей индексного и прямого праймера, чтобы их можно было сохранить. после демультиплексирования с QIIME [29]. После демультиплексирования 454 последовательности были очищены от шумов с помощью QIIME Denoiser в соответствии со стандартным протоколом QIIME. Наборы данных V4-V5 Illumina изначально были демультиплексированы с помощью MiSeq Reporter v2.0. Последовательности, соответствующие прямому и обратному праймерам, были вырезаны из демультиплексированных считываний с использованием cutadapt (http://code.google.com/p/cutadapt/) с использованием настроек строгости, аналогичных тем, которые использовались для последовательностей 454. Затем обрезанные пары чтения были объединены в отдельные контиги с помощью SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) с последующим этапом фильтрации по длине перед анализом с помощью QIIME. Пары чтения Illumina V4 были объединены и отфильтрованы по длине аналогично тому, как считывает V4-V5, чтобы сформировать одиночные контиги перед демультиплексированием с QIIME.Чтения из всех наборов данных были качественно отфильтрованы с использованием минимального значения Q20 во время демультиплексирования. Чтобы обеспечить равномерную обработку и сравнение всех наборов данных последовательностей для семи источников выборки, демультиплексированные последовательности для всех наборов данных были объединены и обработаны как единый массив данных для анализа QIIME.

Мы использовали QIIME версий 1.6 и 1.7 для выполнения кластеризации OTU и анализа альфа- и бета-разнообразия [29]. Кластеризация OTU на основе ссылок выполнялась с использованием параллельного метода uclust_ref, тогда как кластеризация de novo OTU выполнялась с помощью стандартного uclust с использованием параметров по умолчанию, реализованных в QIIME для обоих методов на уровне сходства 97%.Для эталонной кластеризации OTU и выравнивания de novo OTU мы использовали раздел V4-V5 97% кластеризованного эталонного выравнивания OTU NAST по Greengenes [30], [31]. Изначально использовалась версия базы данных Greengenes 2012–2010 годов, поскольку на момент начала анализа это была текущая версия. После того, как версия 2013-08 стала доступной, вся обработка была повторно запущена с новой версией, что позволило нам изучить влияние самой ссылки на анализ и интерпретацию данных. Присвоение таксономии было выполнено с использованием классификатора RDP после переобучения с использованием вышеупомянутых эталонных последовательностей Greengenes и их соответствующих файлов таксономии, как рекомендовано Вернером и др. [32].Проверка химеры была выполнена с использованием ChimeraSlayer со стандартными опциями, реализованными в QIIME, в отношении области V4-V5 эталонного выравнивания Greengenes.

Более подробное описание нашего создания справочных файлов Greengenes для V4-V5 и различных используемых методов обработки QIIME представлено в дополнительных методах (файл S1). Скрипты (denovo.sh, Ref.sh, RDS.sh), используемые для анализа QIIME, также включены в дополнительный материал (файл S2).

Данные о последовательностях, созданные и использованные в этом исследовании, были депонированы в Европейском архиве нуклеотидов SRA под идентификатором проекта PRJEB4688.

Мы провели сравнение пиросеквенирования 454 и секвенирования Illumina ампликонов 16S путем анализа четырех различных библиотек секвенирования для шести различных образцов естественного микробного сообщества: гипервариабельная область V4, секвенированная на Illumina MiSeq (V4.I), V4-V5 Библиотека Illumina, очищенная в геле (V4V5.Ia), вторая библиотека V4-V5 Illumina, очищенная с помощью AMPure (V4V5.Ib), и библиотека пиросеквенирования V4-V5 454 (V4V5.454). Мы также проанализировали одну библиотеку V4-V5 454 и две реплики библиотеки Illumina V4 и V4-V5 для сообщества синтетических имитаторов.Поскольку одним из заявленных преимуществ секвенирования Illumina является более низкий уровень ошибок по сравнению с пиросеквенированием 454 [15], [16], мы сначала сравнили общее качество последовательностей, сгенерированных в каждом цикле секвенирования. Хотя эти значения представляют собой прогнозируемую, а не абсолютную частоту ошибок, они являются наиболее часто используемым прокси для проверки качества последовательности и, следовательно, одним из основных показателей, используемых при предварительной обработке данных. Средний показатель качества PHRED (Q-score) для каждой базы на протяжении считывания имел среднее значение Q39 в V4V5.454 набора данных (рис. 1) и представляли собой стандарт, с которым сравнивались наборы данных Illumina. По мере того как частота ошибок последовательностей Illumina увеличивается на 3′-концах каждого считывания, на что указывает падение Q-показателей, мы объединили парные считывания Illumina, чтобы сформировать единый согласованный контиг перед анализом качества и QIIME. Этот процесс служит для минимизации эффектов ошибок секвенирования путем формирования согласованной последовательности из перекрывающихся концов считываний, как было продемонстрировано ранее [22]. Медиана Q-балла для каждой базы консенсусного контига после слияния считываний была аналогична или выше, чем у набора данных 454 (рис.1), демонстрируя, что путем слияния парных считываний секвенирования Illumina мы могли бы получить отдельные контиги такой же длины, как 454 пиросеквенирование, но более высокого среднего качества.Кроме того, улучшения программного обеспечения для вызова базовых данных Illumina для анализа в реальном времени (RTA), которые произошли в ходе этого исследования, привели к значительно более высоким Q-оценкам для баз на более поздних этапах считывания, что соответствует большей уверенности в вызовах базовых данных. Это улучшение можно увидеть в чтениях из набора данных V4V5.Ib, которые имеют более высокие медианные Q-баллы для баз в области перекрытия, чем набор данных V4V5.Ia, который был секвенирован с использованием более ранней версии программного обеспечения RTA (рисунок 1) . Дополнительные улучшения от Illumina в отношении длины считывания MiSeq и анализа данных на приборе теперь предполагают, что теперь возможно объединение парных считываний с более длинных ампликонов, таких как те, которые охватывают области V1-V3.В целом, после слияния считываний большая часть считываний из прогонов секвенирования Illumina была сохранена после демультиплексирования по сравнению с данными V4V5.454 при использовании того же порога качества Q20 (данные не показаны).

График, изображающий медианное значение базовых показателей качества PHRED (Q-балл) для полной длины 454 и объединенных показаний Illumina из шести выборок естественных сообществ. Данные V4 показаны оранжевым цветом, первый запуск V4-V5 Illumina (V4V5.Ia) — светло-зеленым, второй прогон (V4V5.Ib) — темно-зеленым, а данные 454 — синим. Размер и перекрывающиеся области ампликонов V4 и V4-V5 Illumina показаны черным цветом под графиками качества. Считывание 1 для секвенирования Illumina изображено сплошной линией, а считывание 2 — пунктирной линией, с острием стрелок, показывающих направление считывания относительно положения основания E. coli, заданного вдоль оси X.

Хотя мы наблюдали, что общее качество чтения было выше в наборах данных Illumina по сравнению с набором данных пиросеквенирования 454, в ходе нашего анализа мы выявили небольшой процент считываний в наборах данных Illumina, которые не принадлежали в демультиплексированном наборе данных для данной выборки, результат, который мы не наблюдали ни в одном из 454 наборов данных.Источник этих считываний может быть связан с двумя отдельными проблемами, которые характерны для систем секвенирования Illumina и особенно для MiSeq. Первым источником этих неправильных считываний был перенос образцов из предыдущего цикла секвенирования в последующий цикл секвенирования. Это происходит, когда образцы из предыдущего цикла остаются в жидкостных линиях системы и смешиваются с новыми образцами в последующих циклах секвенирования [33]. Если идентичные индексы используются в последовательных прогонах секвенирования, то перенос считываний из предыдущей библиотеки может искусственно предполагать присутствие OTU с низким содержанием, которые на самом деле не присутствуют в последующем образце.

Второй источник ошибочных чтений, который мы определили, был из других библиотек, которые были секвенированы во время того же цикла секвенирования. Это было наиболее заметно для наборов данных V4V5.Ib, которые мы секвенировали одновременно с библиотеками ампликонов, созданными для нерибосомных генов. Как библиотеки 16S V4V5.Ib, так и нерибосомные библиотеки имели разные шесть основных индексов TruSeq, и мы определили, что ~ 0,06% считываний в библиотеках 16S были последовательностями из библиотек нерибосомных ампликонов. Это был первый раз, когда нерибосомные библиотеки были секвенированы, таким образом, загрязнение не могло быть связано с переходящим загрязнением трубопроводов жидкости из предыдущего цикла, как отмечалось выше.Кроме того, библиотеки 16S и не-рибосомные библиотеки были приготовлены полностью независимо друг от друга и были объединены только непосредственно перед загрузкой в ​​MiSeq, что исключало вероятность контаминации во время подготовки библиотеки. После консультации с представителями Illumina мы предполагаем, что этот результат связан с ошибками секвенирования и / или анализа изображений на этапе секвенирования индекса в прогоне MiSeq, который происходит как отдельный этап процесса секвенирования и, вероятно, вызвал небольшое количество ампликонов. из одной библиотеки неправильно присвоить индекс, соответствующий другой библиотеке.Хотя мы могли бы адекватно идентифицировать контаминирующие нерибосомные последовательности и удалить их из наших наборов данных 16S, прежде чем приступить к последующему анализу, этот результат предполагает, что подобный уровень несоответствия индекса может возникнуть между различными библиотеками 16S при секвенировании в одном цикле, что будет искусственно завышать показатели альфа-разнообразия и искажать интерпретацию результатов при исследовании OTU с низкой численностью.

Помимо неверного присвоения индекса и / или переноса выборки из библиотек с аналогичным индексом, мы также идентифицировали чтения из генома ΦX174 (phiX) во всех необработанных наборах данных Illumina.Эти считывания исходят из неиндексированной контрольной библиотеки phiX, которая добавляется к запускам секвенирования Illumina в качестве встроенной контрольной библиотеки и не может быть результатом загрязнения во время создания библиотеки. Раньше для секвенирования ампликонов 16S на MiSeq требовалось, чтобы phiX составлял 50–90% пропускной способности цикла, как это было при секвенировании библиотек V4.I и V4V5.Ia. Обновления программного обеспечения MiSeq RTA для вызова базовых данных (начиная с версии 2.2) снизили количество phiX, которое рекомендуется добавлять в прогоны секвенирования ампликонов, до 2–5%, однако считывания phiX все еще наблюдались в необработанном V4V5.Наборы данных Ib, которые мы секвенировали с помощью обновленного программного обеспечения RTA и только 2,5% phiX. Чтобы не допустить, чтобы присутствие считываний phiX в наборах данных Illumina не влияло на наш последующий анализ, мы включили в наши конвейеры предварительной обработки Illumina шаг для выявления и удаления этих считываний перед анализом с помощью QIIME.

Поскольку секвенирование Illumina с помощью MiSeq обычно дает как минимум в 10 раз больше последовательностей, чем пиросеквенирование 454, в недавних публикациях, посвященных секвенированию ампликона Illumina 16S, использовались и рекомендовались методы кластеризации OTU на основе эталонов, чтобы пользователи могли быстро обрабатывать свои данные [ 18].Хотя эталонная кластеризация OTU использовалась для анализа 454 данных, многие исследователи по-прежнему выбирают методы кластеризации de novo OTU для анализа 454 данных, поскольку этот метод восстанавливает OTU, которых нет в эталонных наборах данных. Таким образом, мы исследовали, какое влияние эти два метода кластеризации оказали на анализ данных и интерпретацию результатов. Мы выполнили de novo кластеризацию OTU для большого набора данных с использованием стандартных методов QIIME для обработки данных пиросеквенирования с uclust, используемого для кластеризации OTU, и проверки химер, выполненной с помощью ChimeraSlayer, в то время как эталонная кластеризация OTU выполнялась с параллельной версией uclust_ref по сравнению со ссылкой Greengenes 2012–10 поскольку это был текущий релиз Greengenes в то время.Эти два метода кластеризации дали очень разные результаты: количество наблюдаемых OTU и количество последовательностей, назначенных OTU, было меньше при выполнении кластеризации на основе ссылок, чем кластеризация de novo для того же набора данных (таблица S1, рисунок 2a).

Корреляция между методами кластеризации OTU показана путем построения графика количества необработанных (a) и отфильтрованных (b) OTU, наблюдаемых при использовании кластеризации de novo OTU по сравнению с эталонным методом или методом RDS.Результаты кластеризации OTU на основе эталонов показаны квадратами, а результаты кластеризации RDS OTU — кружками. Открытые маркеры обозначают образцы, в которых использовался справочный материал Greengenes 2012, а закрытые маркеры обозначают образцы, в которых использовался справочный материал Greengenes 2013. Результаты de novo изображены серыми ромбами. Линии линейной регрессии показаны для эталонных наборов данных и наборов данных RDS, пунктирные линии соответствуют наборам данных, обработанным с использованием справочного материала Greengenes 2012–10, а сплошные линии соответствуют наборам данных, обработанным с использованием справочного материала Greengenes 2013–08.

Одним из факторов, повлиявших на разницу между двумя методами кластеризации, было то, что большое количество последовательностей не удалось назначить эталонной OTU (таблица S1). В среднем только 65% считываний для данного набора данных были назначены эталонной OTU, хотя масштаб этого эффекта сильно различается между разными выборками. Например, более 90% считываний из каждого набора данных стула человека были отнесены к эталонной OTU, в то время как для образца термитов только от 30% до 40% считываний из наборов данных V4-V5 были присвоены эталонной OTU (таблица S1).Поскольку выпуск Greengenes 2013 произошел, когда мы выполняли анализ данных, мы повторили эталонную кластеризацию OTU, используя этот новый эталон, поскольку выпуск 2013 года включает большее количество эталонных последовательностей, чем выпуск 2012 года. При использовании версии Greengenes 2013 для эталонной кластеризации OTU мы заметили, что большее количество последовательностей было назначено эталонной OTU и большее количество OTU на наблюдаемый образец по сравнению с использованием версии 2012 года. Даже с этим улучшением по сравнению с эталоном 2012 года мы по-прежнему не наблюдали такого же количества OTU, как в кластерных наборах данных de novo (таблица S1, рисунок 2a).Эта разница в количестве OTU, основанная на эталонной или de novo кластеризации OTU, перенесена в расчет показателей альфа-разнообразия, хотя анализы бета-разнообразия, особенно те, которые используют взвешенную метрику UniFrac на основе филогенетического дерева, пострадали меньше (данные не показаны).

Чтобы более точно воспроизвести результаты кластеризации de novo OTU при сохранении эффективности обработки кластеризации эталонных OTU, мы разработали конвейер анализа, который сначала выполняет параллельную кластеризацию эталонных OTU с использованием 97% Greengenes OTU в качестве эталона, за которыми следует de novo кластеризация OTU и проверка химеры с помощью ChimeraSlayer последовательностей, которые не удалось назначить эталонному OTU.Как обсуждается ниже, этот справочник плюс кластеризация de novo OTU с конвейером ChimeraSlayer, который мы называем RDS, позволили получить такие же меры альфа-разнообразия, таксономический состав и сравнение бета-разнообразия, как и метод кластеризации de novo OTU, проверенный химерой. В отличие от аналогичного метода открытой эталонной кластеризации uclust_ref, реализованного в QIIME, который может работать только на одном ядре обработки, эта разделенная реализация использует преимущество возможности выполнять эталонную кластеризацию OTU по нескольким ядрам обработки, сокращая общее время анализа и, следовательно, более удобен для обработки больших наборов данных Illumina.

Мы сравнили количество наблюдаемых OTU и метрики альфа-разнообразия Симпсона (D), Шеннона (H ‘) и филогенетического расстояния (PD), сгенерированные методом RDS с использованием каждой из ссылок Greengenes, с метриками, полученными с помощью de novo и эталонной кластеризации OTU. . Используя любую ссылку Greengenes, количество OTU, сгенерированных с использованием метода RDS, было больше похоже на количество OTU, полученных с помощью кластеризации de novo, чем для одной только эталонной кластеризации OTU (таблица 2, рисунок 2). Хотя величина разницы в количестве OTU между методами обработки варьировалась для каждого набора данных, в среднем результаты обработки на основе справочных данных составили 23.На 7% отличается от de novo, тогда как обработка RDS отличается на 12%. При анализе с помощью ANOVA количество сгруппированных по ссылкам OTU значительно отличалось от результатов кластеризации OTU de novo (p <0,01), но не было статистической разницы между методом RDS и de novo (p> 0,05). По сравнению с кластеризацией OTU de novo, показатели альфа-разнообразия, сгенерированные с использованием метода кластеризации RDS, имели коэффициенты корреляции Пирсона, близкие к 1, и более подходящие линейные кривые, чем меры с кластеризацией по эталонам, что указывает на то, что метод RDS лучше воспроизводит результаты кластеризации OTU de novo чем кластеризация OTU на основе ссылок.

Несмотря на то, что метод обработки RDS воспроизводил результаты кластеризации de novo OTU лучше, чем кластеризация OTU на основе эталона, согласно исследованным нами измерениям альфа- и бета-разнообразия, почти во всех наборах данных Illumina было большее количество OTU чем сообщалось для аналогичных образцов в литературе.В частности, наборы данных Illumina ложного сообщества содержали от 25 до 125 раз больше OTU, чем ожидалось, исходя из анализа имеющихся эталонных последовательностей генома. Одним из факторов, способствующих этому увеличению, может быть упомянутое выше загрязнение набора данных, которое можно частично решить с помощью стратегий фильтрации OTU для удаления OTU, которые составляют низкий процент от общего числа считываний, как рекомендовано для наборов данных Illumina Бокуличом и др. [34] Анализ различных методов фильтрации и пороговых значений показал, что ни одно значение фильтрации не работало одинаково хорошо для всех выборок, поскольку пороговые значения, которые уменьшали количество OTU в имитационных выборках сообщества до разумных значений, были чрезмерно ограничивающими для других выборок (Таблица S2) .Ручное изучение репрезентативных последовательностей OTU из наборов данных фиктивного сообщества Illumina показало, что большая часть из них представляла химеры между двумя или более видами из сообщества. Поскольку высокосинтетический характер фиктивного сообщества не очень отражает богатство и однородность естественных выборок, мы решили удалить одно- и двухэлементные OTU из полной таблицы OTU как ложное считывание с последующей фильтрацией OTU, представляющих менее 0,005% от общего объема. все последовательности, рекомендованные Bokulich et al.[34] В то время как количество OTU, наблюдаемых с эталонной кластеризацией по сравнению с эталоном Greengenes 2013, было больше похоже на de novo после реализации шага фильтрации OTU, линейный регрессионный анализ показал, что метод RDS по-прежнему дает результаты, более отражающие кластеризацию de novo OTU (рисунок 2б).

После обработки наборов данных с использованием метода RDS и включения этапа фильтрации OTU, показатели альфа-разнообразия для каждого из наборов данных Illumina имели больше OTU и большее филогенетическое расстояние (PD), чем соответствующий набор данных 454 (Таблица 2).Мы наблюдали аналогичный результат при выполнении кластеризации наборов данных de novo OTU с шагом фильтрации OTU. За исключением одного из фиктивных наборов данных сообщества, все наборы данных Illumina для выборки имели большее количество входных последовательностей, чем соответствующий набор данных 454. Чтобы различия в глубине секвенирования не влияли на наши сравнения секвенирования 454 и Illumina, мы нормализовали количество последовательностей в наборах данных для выборки, уменьшив каждый набор данных до количества считываний в соответствующем наборе данных 454.Самый маленький фиктивный набор данных Illumina сообщества был исключен из этого анализа. После разрежения количество OTU, наблюдаемых в наборах данных Illumina, все еще было больше, чем в соответствующем наборе данных 454 (Таблица 3), хотя степень различия была меньше для образцов с более высоким разнообразием (рубец, сточные воды, термиты), чем для образцов с низким разнообразием ( человеческий стул, пиявка, мышь).

Нормализованное количество последовательностей представляет собой количество последовательностей, к которым каждый набор данных данной выборки был нормализован с помощью разрежения, чтобы можно было проводить внутривыборочные сравнения наборов данных.

Когда мы сравнили количество OTU в наборах данных Illumina V4 и V4-V5 для каждой выборки, в наборе данных V4 постоянно было меньше OTU, чем в соответствующих наборах данных Illumina V4-V5.По сравнению с ампликонами V4-V5, ампликоны V4 на ~ 100 п.н. короче и покрывают только одну гипервариабельную область. Большее количество OTU для наборов данных Illumina V4-V5 по сравнению с V4 после разрежения предполагает, что увеличенная информация о последовательности, доступная для анализа за счет включения гипервариабельной области V5, позволила различить новые OTU, которые не могли быть дифференцированы на основе Только регион V4.

Анализ бета-разнообразия всех наборов данных показал, что каждый источник образца представляет отдельный микробиом независимо от используемого метода обработки.Каждый из отдельных наборов данных сгруппирован вместе на основе их исходного источника выборки, что определяется анализом основных координат расстояний Брея-Кертиса и UniFrac между каждым набором данных (рис. 3). Эта кластеризация не зависела от гипервариабельных областей, выбранных для секвенирования, V4 или V4-V5, или используемой платформы секвенирования, GS FLX или MiSeq, что указывает на то, что эти факторы не оказали очевидного влияния на интерпретацию анализов бета-разнообразия при сравнении различных группа образцов, которую мы использовали в этом исследовании.Хотя метод RDS не дал результатов бета-разнообразия, идентичных тем, которые были получены при использовании кластеризации de novo OTU, общая интерпретация результатов между двумя методами была аналогичной. Основное различие, которое мы наблюдали, заключалось в том, что при использовании метрики Брея-Кертиса было показано, что выборки людей, мышей и ложных сообществ более похожи друг на друга, когда данные обрабатывались с использованием метода RDS, по сравнению с использованием кластеризации de novo OTU. Этот результат был аналогичен тому, что мы наблюдали при выполнении только кластеризации эталонных OTU, и предполагает, что эти три образца совместно используют больший процент OTU в результате этапа кластеризации эталонных OTU метода RDS, чем мы наблюдали при кластеризации de novo (рисунок S1 ).

Трехмерные графики анализа основных координат, показывающие взаимосвязь наборов данных с использованием метрики Брея-Кертиса (A) и взвешенного UniFrac (B). Индивидуальные наборы данных представлены в сферах, которые окрашены в соответствии с их источником образца следующим образом: человеческий стул — коричневый, кишечник пиявки — фиолетовый, тонкий кишечник мыши — оранжевый, ложное сообщество — синий, неприлипающее содержимое рубца — красный, смешанная жидкость — зеленый Задняя кишка термитов — золото.

Из-за больших общих различий между семью выборками, как определено анализом основных координат, мы также провели анализ бета-разнообразия наборов данных для каждой выборки независимо. В каждом случае набор данных V4 Illumina последовательно более отличался от соответствующих наборов данных V4-V5, чем наборы данных V4-V5 друг от друга, что указывает на то, что выбор гипервариабельной области оказал большее влияние на бета-разнообразие, чем выбор секвенирования. технологии (рисунок S2).

В то время как измерения альфа- и бета-разнообразия обеспечивают важное понимание структуры и взаимоотношений микробных сообществ, ключевым аспектом создания гипотез о функциональных и физиологических аспектах микробного сообщества является зная его таксономический состав. Мы определили влияние гипервариабельной области, выбранной для секвенирования, и метода кластеризации OTU, используемого для анализа, на таксономический состав выборки путем сравнения сводок таксономии для каждого набора данных при обработке с использованием de novo, на основе ссылок и RDS. Методы кластеризации OTU.Эти сравнения показали, что для некоторых образцов было большое влияние на наблюдаемый таксономический состав от выбора секвенированных гипервариабельных участков или использованного метода кластеризации OTU.

Мы протестировали три конвейера обработки данных, используя контрольную ДНК из синтетического фиктивного сообщества, созданного в рамках проекта «Микробиом человека» (HMP), чтобы определить, вносит ли один метод обработки источник систематической ошибки [7]. Мнимая ДНК сообщества, используемая для библиотек Illumina, включала 20 культивируемых видов бактерий, в то время как ДНК, используемая для библиотеки 454, также включала Porphyromona gingivalis.Ни один из полученных наборов данных не показал таксономический состав, который был бы идентичен известному составу фиктивного сообщества, однако каждый из трех методов обработки (de novo, reference, RDS) давал аналогичный таксономический состав для каждого из трех типов библиотек ( V4.I, V4V5.I и V4V5.454, рисунок 4).

График сравнения таксономического состава фиктивной выборки сообщества для трех различных типов библиотек, секвенированных при обработке тремя разными способами.Повторяющиеся наборы данных Illumina V4 и V4-V5 были объединены в один репрезентативный набор данных для каждого типа библиотеки. Все таксономические присвоения были выполнены с использованием классификатора RDP после переподготовки со ссылкой на Greengenes 2013-08 гг. Таксономические ранги обозначаются буквами перед названием таксона следующим образом: род — g, семейство — f, порядок — o.

На численность некоторых таксонов сильно повлияли тип созданной библиотеки и метод обработки. В библиотеках V4 Illumina род Propionibacterium практически полностью отсутствовал, тогда как в библиотеках V4-V5 он составлял ~ 1.5% из 454 наборов данных и 2,4–2,9% из наборов данных Illumina. Этот результат, вероятно, был обусловлен специфичностью праймера праймеров V4 по сравнению с праймерами V4-V5, поскольку существует разница в одной паре оснований между прямым праймером V4 и сайтом отжига на основе эталонного генома P. acnes. Во всех трех типах библиотек мы постоянно наблюдали, что род Listeria был идентифицирован только при использовании кластеризации de novo OTU, тогда как семейство Listeriaceae вместо этого наблюдалось при использовании эталонных методов или методов обработки RDS.Точно так же род Escherichia был идентифицирован лишь частично в любом из наборов данных независимо от обработки, а семейство Enterobacteriaceae вместо этого было преобладающим таксономическим назначением для этих OTU. Интересно отметить, что этот результат имел место только тогда, когда выпуск Greengenes 2013 использовался для назначения таксономии, поскольку OTU были правильно классифицированы как Escherichia, когда мы использовали версию справочника 2012 года.

Несмотря на то, что таксономический состав ложных наборов данных сообщества показал незначительную или отсутствующую специфическую систематическую ошибку, связанную с выбором секвенирования гипервариабельных областей или использованного метода обработки данных, мы действительно наблюдали некоторые отчетливые различия в шести образцах естественного микробного сообщества, которые мы проанализировали.Во время нашего первоначального анализа с использованием справочника Greengenes 2012 для кластеризации OTU и таксономического назначения мы заметили, что для некоторых выборок использование только справочной кластеризации часто пропускает целые таксоны. Наиболее ярким примером этого были библиотеки V4-V5 для образца термитов, для которого класс Endomicrobia почти полностью отсутствовал в эталонных кластерных наборах данных, но составлял почти 30% сообщества при использовании de novo или методов обработки RDS ( Рисунок 5). Хотя эта проблема была в значительной степени решена с выпуском Greengenes 2013, таксономический состав обработанных наборов данных RDS был больше похож на кластерные наборы данных de novo OTU, чем на эталонные кластерные наборы данных.В образце термитов различия между библиотеками V4 и V4-V5 были наиболее очевидными. Хотя библиотеки V4-V5 Illumina и 454 статистически не отличались друг от друга, библиотека V4 значительно отличалась от обеих библиотек V4-V5 (данные не показаны). В библиотеках V4-V5 род Treponema составлял ~ 45% сообщества, но почти 75% в библиотеке V4 независимо от метода обработки (рис. 5). Хотя мы не смогли определить точную причину этого несоответствия по данным, возможно, что систематическая ошибка амплификации праймеров способствовала этому результату.

График сравнения таксономического состава образца задней кишки термитов для трех различных типов библиотек, секвенированных при обработке с использованием трех разных методов. Повторяющиеся наборы данных Illumina V4 и V4-V5 были объединены в один репрезентативный набор данных для каждого типа библиотеки. Таксономические присвоения были сделаны с использованием классификатора RDP после переподготовки с использованием ссылок Greengenes 2012–10 или 2013-08 годов.Таксономические ранги обозначаются буквами перед названием таксона следующим образом: род — g, семейство — f, порядок — o, класс — c, тип — p, домен — d.

В наборах данных образцов стула человека численность двух наиболее распространенных родов, Bacteroides и Escherichia, сильно различалась между каждым из трех типов библиотек (рисунок S2). Хотя различия между библиотеками V4 и V4-V5, вероятно, связаны с выбором разных праймеров, род Bacteroides был более распространен в библиотеках V4-V5 Illumina по сравнению с 454 (~ 65% vs.55%), в то время как Escherichia была гораздо менее многочисленна (∼10% против ∼28%). Эта разница в изобилии между двумя типами библиотек V4-V5 наблюдалась даже после нормализации наборов данных по разрежению и, таким образом, не отражает напрямую смещение глубины выборки. Как отмечалось выше для фиктивных наборов данных сообщества, род Escherichia был идентифицирован только в наборах данных, обработанных с использованием справочника Greengenes 2012 для присвоения таксономии, за единственным исключением наборов данных V4-V5 Illumina, обработанных с использованием метода RDS.В этом случае род Escherichia наблюдался при использовании эталона 2013 года, но не на том же уровне, что и при использовании эталона 2012 года (рис. S2). Мы наблюдали аналогичные различия в таксономическом составе образца, соответствующего типу библиотеки, для других пяти образцов естественного сообщества, которые мы проанализировали, хотя эти различия были незначительными для наборов данных о рубце и сточных водах, которые имели самое высокое общее таксономическое разнообразие из семи проанализированных нами образцов.

. Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить, насколько хорошо секвенирование Illumina может служить прямой заменой пиросеквенирования 454 при использовании существующих праймеров для секвенирования 16S и рабочих процессов анализа.Чтобы определить это, мы проанализировали шесть естественных микробных сообществ и фиктивное сообщество, используя как пиросеквенирование 454, так и секвенирование Illumina гипервариабельной области V4-V5 гена 16S рРНК. Мы дополнительно выполнили Illumina секвенирование области V4, используя протокол, разработанный Caporaso et al. [18], который был принят в качестве стандартного протокола для секвенирования Illumina 16S исследователями, участвующими в проекте Earth Microbiome Project. Поскольку отдельные чтения, сгенерированные с помощью MiSeq, короче, чем отдельные чтения, сгенерированные GS FLX, а предыдущие исследования [22] и наш собственный анализ показали, что частота ошибок увеличивается к 3′-концу чтения, мы использовали слияние чтения парные чтения Illumina для создания единого согласованного чтения Illumina с длиной, аналогичной длине, полученной при секвенировании 454.На этом этапе предварительной обработки наборов данных Illumina были получены объединенные считывания с более высоким средним качеством, чем для считываний, сгенерированных пиросеквенированием 454 (рисунок 1), а также большее количество считываний на образец (таблица 2).

При анализе всех наборов данных из выборок в массе мы наблюдали небольшие различия в показателях альфа-разнообразия между наборами данных пиросеквенирования и Illumina для образцов с высоким разнообразием, в то время как большие различия наблюдались для образцов с низким разнообразием.И наоборот, графики PCoA анализов бета-разнообразия показали, что использованный метод секвенирования (454 или Illumina) или выбранные вариабельные области (V4 или V4-V5) практически не имели видимого эффекта, поскольку каждый набор данных из данного образца сгруппирован вместе (рис. 3). Однако анализ отдельных наборов данных для каждой выборки показал, что набор данных V4 последовательно более отличался от наборов данных V4-V5, чем наборы данных V4-V5 друг от друга (рисунок S2). Частично это различие проистекает из использования праймеров, которые отжигаются с разными областями гена 16S рРНК для создания библиотеки, которые, вероятно, имеют разные ошибки амплификации и специфичность матрицы [35], [36].Эта систематическая ошибка была очевидна при изучении таксономического состава ложных наборов данных сообщества, которые все имели несколько разную численность для каждого таксона по трем изученным нами типам библиотек, а род Propionibacterium практически отсутствовал в библиотеках V4. Хотя мы наблюдали различия между наборами данных V4-V5 454 и V4-V5 Illumina, эти различия не оказали существенного влияния на общую интерпретацию анализов бета-разнообразия, хотя их влияние на таксономический состав варьировалось в зависимости от выборки.На основе наших общих результатов мы можем сделать вывод, что исследователи, которые хотят перейти на секвенирование Illumina с пиросеквенирования 454, должны иметь возможность модифицировать свои существующие праймеры, просто заменяя последовательности адаптера 454 последовательностями адаптера Illumina TruSeq. Дополнительным вариантом для исследователей, которые не нуждаются или не хотят адаптировать заранее установленный рабочий процесс 454, является использование одного из опубликованных форматов секвенирования V4, разработанных для секвенирования Illumina Caporaso et al. или Kozich et al. [18], [22] Хотя выбор другой гипервариабельной области для анализа действительно повлиял на результаты в зависимости от образца, наш анализ показывает, что в целом ампликоны V4 давали такие же показатели альфа- и бета-разнообразия, что и Ампликоны V4-V5.

Одно из основных различий между приборами Roche 454 GS FLX и Illumina MiSeq заключается в том, что MiSeq в настоящее время способен генерировать более чем в 10 раз больше считываний последовательностей, чем GS FLX, за один цикл секвенирования. В сочетании с гораздо более низкими эксплуатационными расходами секвенирование Illumina на MiSeq дает исследователям возможность секвенировать отдельные образцы на большую глубину отбора образцов, чем это возможно с GS FLX, и / или включать больше образцов в один цикл секвенирования за счет увеличения мультиплексирования штрих-кодов. библиотеки.Однако по мере увеличения глубины секвенирования в результирующий набор данных может быть включено большее количество ошибочных последовательностей, что приведет к искусственному смещению оценок альфа-разнообразия посредством генерации ложных OTU. Эти ошибочные последовательности часто возникают из-за образования химер и ошибок ПЦР во время подготовки библиотеки или являются результатом ошибок секвенирования, которые не были идентифицированы и удалены во время обработки данных. Протоколы были разработаны для 454 пиросеквенирования, чтобы минимизировать присутствие и влияние нелегитимных последовательностей / OTU на анализ разнообразия, и мы включили эти протоколы по мере необходимости в нашу библиотеку, методы обработки и анализа [37] — [39].

Чтобы минимизировать влияние ошибок секвенирования, мы сначала объединили парные чтения Illumina, чтобы сформировать единую согласованную последовательность перед кластеризацией OTU. Этот шаг приводит к большей уверенности в том, что базовые вызовы для объединенной области верны, и, таким образом, сокращает связанные с секвенированием ошибки в наборах данных Illumina (рисунок 1). Мы также включили проверку химер с ChimeraSlayer как часть нашего конвейера анализа RDS. Однако, как продемонстрировано с помощью фиктивных образцов сообщества, секвенированных Illumina, не все химерные OTU были правильно идентифицированы и удалены.Одна из причин этого заключается в том, что процесс проверки химер обычно зависит от сравнения различий в сходстве последовательностей на двух концах последовательности запроса с двумя или более справочными последовательностями, полученными либо из справочной базы данных, такой как Greengenes, либо выбранными из самого набора данных. Этот метод создает проблему при обнаружении, поскольку химеры, присутствующие в коротких последовательностях из близкородственных организмов, труднее идентифицировать, чем в более длинных последовательностях. Кроме того, химерные последовательности, происходящие из трех или более родительских последовательностей, таких как те, которые наблюдаются в наборах данных ложного сообщества Illumina, могут быть идентифицированы не как химерные, а как новые последовательности.

Поскольку объем данных последовательностей, генерируемых приборами Illumina, на несколько порядков больше, чем для GS FLX, конвейеры обработки и анализа, которые были разработаны для обработки наборов данных пиросеквенирования, пришлось изменить для обработки данных Illumina. эффективно. Одной из таких модификаций был переход от использования de novo генерации OTU для больших наборов данных секвенирования к использованию эталонных OTU, например, из эталонных баз данных Greengenes [30], [31] или Silva [40].Основное преимущество эталонной кластеризации OTU состоит в том, что она значительно быстрее, чем генерация OTU de novo, поскольку ее можно запускать параллельно на нескольких ядрах обработки, а доступность эталонных наборов данных с предварительно построенными филогенетическими деревьями и таксономиями позволяет упростить и получить больше эффективный конвейер анализа. Тем не менее, с одной только кластеризацией OTU на основе эталонов наблюдаемое микробное разнообразие образца может быть столь же разнообразным, как и сам эталонный набор, что может искусственно ограничивать наблюдаемое разнообразие для очень разнообразных или экзотических сред, микробные популяции которых имеют мало репрезентативных последовательностей в эталонных базах данных. .

В этом исследовании мы обнаружили, что выполнение кластеризации OTU на основе ссылок с использованием ссылок Greengenes 2012 или 2013 привело к сокращению количества наблюдаемых OTU по сравнению с кластеризацией de novo OTU (таблицы 2 и S1, рисунок 2). Использование только эталонной кластеризации OTU также оказало большое влияние на наблюдаемую таксономию некоторых выборок, при этом некоторые таксоны полностью отсутствовали или были неправильно идентифицированы при использовании эталонной кластеризации по сравнению с de novo (рис. 5). Хотя кураторы базы данных Greengenes приложили большие усилия для расширения своих базовых наборов данных, чтобы включить в них больше последовательностей из очень разнообразных и сложных микробных сообществ, наши результаты показывают, что необходимы дополнительные улучшения для обеспечения лучшего охвата многих микробных сред, не связанных с человеком.Это особенно важно, поскольку все большее число исследователей используют низкую стоимость секвенирования Illumina для характеристики микробных сообществ во многих новых и разнообразных средах, которые могут быть недостаточно представлены в текущих справочных базах данных.

Как мы продемонстрировали, один из вариантов, который есть у исследователей, — это выполнить кластеризацию эталонных OTU, а затем проанализировать уменьшенное количество последовательностей, которые не соответствуют набору эталонных данных, с использованием кластеризации de novo OTU, которую мы описали выше как эталон плюс de novo с ChimeraSlayer, или метод RDS.Наши результаты продемонстрировали, что метод RDS производит альфа (таблица 2) и бета (рисунок 2) метрики разнообразия и сводки таксономии (рисунок 3), которые больше похожи на кластеризацию de novo OTU, чем на кластеризацию только на основе ссылок. В то время как текущая реализация выбора открытой ссылки uclust_ref позволяет создавать de novo OTU из операций чтения, не назначенных ссылочной последовательности, этот процесс ограничен запуском на одном ядре обработки. Наша реализация двух отдельных шагов для эталонной кластеризации и кластеризации de novo OTU в методе RDS позволяет выполнять эталонную кластеризацию по нескольким ядрам обработки.Этот метод гибридного анализа позволяет исследователям эффективно анализировать большие наборы данных секвенирования, созданные с помощью платформ секвенирования Illumina, сохраняя при этом возможность идентифицировать новые OTU, которые в настоящее время отсутствуют в базовых наборах данных.

Хотя это не всегда возможно, априорное знание общего состава микробного сообщества может обеспечить важные проверки для подтверждения результатов высокопроизводительных исследований секвенирования 16S.Наше включение фиктивного сообщества, разработанного проектом Human Microbiome Project, частично служило таким средством контроля для выявления потенциальных проблем с рабочими процессами построения нашей библиотеки, секвенирования и анализа данных. При использовании справочника Greengenes 2012, который был доступен, когда мы начали это исследование, мы обнаружили, что таксономический состав ложных наборов данных сильно отличался от ожидаемого, причем многие OTU классифицировались не по родовому уровню, а по более высоким таксономическим рангам. Выпуск справочной базы данных Greengenes за 2013-08 гг. Решил многие из этих проблем присвоения, однако род Escherichia все еще не был правильно идентифицирован при выполнении таксономического присвоения OTU с помощью ссылки Greengenes 2013, а род Listeria был идентифицирован только в наборах данных, обработанных de novo. .

Во время нашего первоначального анализа образцов кишечника пиявки с использованием эталона Greengenes 2012 никакие OTU не были отнесены к роду Aeromonas ни для одного из наборов данных, независимо от метода обработки, что не согласуется с предыдущими исследованиями на культуре и некультурами, которые мы провели для пиявки. кишечник [41], [42]. Впоследствии мы определили, что это произошло из-за отсутствия каких-либо последовательностей в ссылке Greengenes, аннотированной для рода Aeromonas, с самым низким таксономическим рангом у семейства Aeromonadaceae.После передачи этого и других результатов кураторам Greengenes была выпущена обновленная справочная таксономия (Greengenes 2013-08), которая включала дополнительные аннотации на уровне родов и видов по сравнению с предыдущей версией. Однако даже после выполнения таксономической классификации с помощью этого обновленного справочного материала только одна OTU, представляющая менее 0,2% всех последовательностей в наборах данных V4-V5, была классифицирована как Aeromonas при использовании метода RDS, в то время как все другие OTU были классифицированы как Aeromonadaceae (данные не показано).Важно отметить, что, хотя эта классификация не является технически некорректной, она менее информативна в отношении состава сообщества и потенциально может привести к неточным выводам в ситуациях, когда априорные знания о микробном сообществе неизвестны.

Этот пример также подчеркивает необходимость более широких усилий сообщества для обеспечения максимально возможной точности больших базовых наборов данных, таких как Greengenes. Поскольку текущая версия базы данных Greengenes включает более 1 миллиона отдельных последовательностей, для ручных и автоматизированных этапов курирования чрезвычайно сложно успешно идентифицировать и удалять все потенциальные химерные последовательности и гарантировать точное таксономическое назначение для всех последовательностей в базе данных.Хотя это оказало заметное влияние на таксономический состав кишечника пиявки, оказалось, что оно практически не повлияло на состав образцов стула, рубца и сточных вод человека. Наши результаты показывают, что исследователи, которые полагаются на эталонный набор данных, например, для кластеризации OTU или назначения таксономии, как мы делаем с методом обработки RDS, должны проявлять осторожность при интерпретации своих результатов.

Хотя наши результаты показывают, что в целом Illumina и пиросеквенирование 454 дало аналогичные результаты по альфа- и бета-разнообразию, мы наблюдали случаи загрязнения наборов данных, которые, по-видимому, специфичны для Illumina ампликонов 16S.Для библиотек, секвенированных в одно и то же время, мы также наблюдали случаи неправильного присвоения индексов, что приводило к небольшому проценту операций чтения из одной библиотеки, которым была неправильно назначена последовательность индекса, соответствующая другой библиотеке. Это стало наиболее очевидным, когда мы секвенировали библиотеки V4-V5.Ib одновременно с библиотеками нерибосомных ампликонов. Источник неверного присвоения индекса, вероятно, возникает из-за ошибок анализа изображений на этапе секвенирования индекса, которые могут быть устранены с помощью будущих обновлений программного обеспечения, оборудования или наборов реагентов MiSeq.Уменьшение плотности целевого кластера для библиотек ампликонов ниже рекомендованных Illumina значений может уменьшить возникновение этой ошибки, а также улучшить качество чтения, как ранее обсуждалось Kozich et al. [22]. Использование двойных форматов индексации, когда индексы присутствуют на обоих концах секвенируемого ампликона, вероятно, уменьшит возникновение неправильного присвоения индекса, поскольку в обоих индексах должны возникать ошибки, чтобы считывание было присвоено неверной выборке. Мы также наблюдали низкий процент чтения из библиотеки управления phiX во всех необработанных наборах данных Illumina, которые мы использовали в этом исследовании.Хотя обновления программного обеспечения MiSeq для базового вызова RTA снизили вероятность того, что чтениям phiX будет неправильно назначена действительная последовательность индексов, они не устранили ее. Мы удалили чтение phiX из наборов данных перед анализом QIIME, применив методы предварительной обработки, описанные выше. Дополнительной проблемой секвенирования Illumina, которую мы не оценили напрямую с помощью наших наборов данных, является низкий уровень переходящего загрязнения, который возникает между последовательными запусками MiSeq. Эта проблема была отмечена в техническом бюллетене Illumina, в котором уровень переходящего загрязнения обычно был меньше 0.1% считываний для цикла переносится в последующий цикл и загрязняет его [33].

Комбинация несоответствия индекса, происходящего со скоростью ~ 0,06%, и переходящего загрязнения между прогонами MiSeq менее 0,1% может обеспечить базовое значение, которое служит порогом, чтобы помочь различить, какие результаты связаны с истинным биологическим сигналом, а какие могут быть вызваны. к шуму. Чтобы смягчить ошибочное определение индекса и загрязнение из остатков образцов для экспериментов, требующих высокого уровня чувствительности, мы начали включать один или несколько проиндексированных контрольных образцов для более точной количественной оценки этого явления.Эти контрольные библиотеки могут быть созданы из синтетического шаблона, чистой культуры или фиктивного сообщества и служить в качестве встроенных элементов управления для определения уровня несоответствия индекса, которое происходит между разными образцами в рамках цикла, и переходящего загрязнения в отдельных циклах секвенирования. Также рекомендуется чередовать индексы, используемые между прогонами, чтобы еще больше снизить потенциальное загрязнение в результате переноса в высокочувствительных экспериментах. В то время как исследователи, которые в первую очередь заинтересованы в выявлении широких изменений в микробном составе, обычно не страдают от неправильного присвоения индекса и переходящего загрязнения, реализация перечисленных выше предложений улучшит качество и точность наборов данных для секвенирования ампликонов, создаваемых на инструментах Illumina.Исследователи сосредоточились на изучении «редкой биосферы» или роли малочисленных организмов в сообществе, возможно, потребуется принять дополнительные меры предосторожности.

Наш анализ показывает, что праймеры, разработанные для инструментов Roche 454, можно легко модифицировать для использования с инструментами Illumina, что дает стабильные результаты. Когда мы использовали одни и те же матричные праймеры, наборы данных, произведенные Illumina, были больше похожи на наборы данных, произведенные 454, чем при использовании различных матричных праймеров. Согласованность между платформами была дополнительно улучшена за счет использования конвейера обработки RDS, максимального повышения качества последовательностей путем объединения парных считываний Illumina и минимизации артефактов за счет использования эталонных наборов данных и включения проверки химер.Чтобы учесть и уменьшить наблюдаемые нами низкие уровни несоответствия индексов и переходящего загрязнения, мы рекомендуем использовать контрольные библиотеки и чередование индексов между последовательными прогонами секвенирования при использовании MiSeq. В целом наши результаты показывают, что секвенирование генов 16S рРНК Illumina является экономически эффективным подходом, который может легко заменить пиросеквенирование 454 в качестве нового стандартного метода анализа микробных популяций.

Достопримечательности и достопримечательности Звенигорода — информация, фото, на карте

Звенигород расположен в 70 км к западу от Москвы на берегу Москвы-реки.Согласно летописи, город был основан в 1152 году князем Юрием Долгоруким. Расцвет Звенигорода пришелся на время правления князя Юрия Звенигородского, когда здесь были построены Саввино-Сторожевский монастырь и Успенский собор. В XVII веке через Звенигород проходило Великое Московское шоссе (Большой Московский тракт) или Королевский тракт. Сейчас это Рублево-Успенское шоссе, одна из самых коротких федеральных трасс, вдоль которой расположены коттеджи известных российских политиков и бизнесменов.

В конце XVII века Звенигород стал промышленным центром. Здесь находились металлургические заводы предпринимателя, мецената и мецената Саввы Морозова. До революции 1917 года Звенигородский уезд был одним из самых развитых в Московской губернии. После Второй мировой войны Звенигород превратился в город-санаторий-курорт, славящийся лесопарками и чистым воздухом, благотворно влияющим на здоровье. Благодаря этим факторам город называют Русской Швейцарией.

Уникальный Саввино-Сторожевский монастырь — удивительно красивый памятник древнерусского зодчества, главная достопримечательность путешественников. Отсюда было удобно предупреждать Москву о приближающихся врагах, так как монастырь стоял на высоком холме, с которого прекрасно просматривались окрестности. Это можно увидеть и сегодня со смотровой площадки, расположенной прямо в монастыре. Обращают на себя внимание несколько великолепных соборов в Звенигороде, а также старинные русские усадьбы.

В местных ресторанах можно попробовать традиционные русские блюда: картофель, тушеный с мясом и грибами в тагине, грибной суп и пироги с мясом, капустой и другими начинками. В Саввино-Сторожевском монастыре невозможно пройти мимо магазина, где продают вкуснейший монастырский хлеб и другую выпечку.