Разное

Грибы в кирилловском 2019: Где сейчас собирают грибы в Ленинградской области? — Грибные места под Петербургом

Прогулки по городу | Интересное — рядом!

Пока на форумах ломают копья в спорах о том, стоит ли ехать в ужасно дикие и опасные места типа Алтая или Мадагаскара на мощном и хорошо экипированном  джипе да и еще тащить туда детей …. мы пройдемся по улицам и паркам нашего города, где можно увидеть много интересного, а также узнать об истории улиц и их названий, о людях, зверях и птицах. А так же, увидеть и прочувствовать странные истории, от которых становится чуточку лучше и веселее. Приглашаем на совместные прогулки!

Рубрика: Без рубрики |

Эта галерея содержит 19 фотографий.

Последний день календарной зимы. Полюбуемся напоследок на зимнюю красоту в Удельном парке. Еще, конечно, будут морозы и неприветливая погода, но весна на подходе. Ждем-с. Все под снегом. Красавицы-елки в парке. Есть совсем молодые, а есть и постарше. Посмотрим на нашу … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 19 фотографий.

Продолжаем прогулку по Эрмитажу. Смотрим на полотна итальянских мастеров. Согласно легенде, Мария Магдалина провела много лет в покаянии в пустыне. В живописи Ренессанса редко можно встретить женский образ, равный по эмоциональной силе созданному Тицианом. Заплаканное лицо, страстно устремленный к небу … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 13 фотографий.

Дошли, наконец, до полотен итальянских живописцев. Вот только несколько картин. У каждой свой стиль и своя история. Тициан (1488/1490-1576) — Бегство в Египет. Полотно «Бегство в Египет» исполнено мастером в юности. В нем еще сказывается сильное влияние Джорджоне, с которым … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 36 фотографий.

Пройдемся по Эрмитажу. На этот раз (который был почти год назад) в планах — итальянское живописное искусство. В таком большом музее немудрено и заблудиться. Пошли сначала в противоположном направлении. Все, конечно, дорого-богато. Не для быдла, чье основное дело — чистка … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 35 фотографий.

Снова вспомним хмурые ноябрь-декабрь. Еще одна поездка недалеко от города — в Шлиссельбург. Да, как-то съездили сюда в мае. Совсем другая картина. Но зато Благовещенский собор почти отреставрирован. Собор Благовещения Пресвятой Богородицы был построен на месте деревянной церкви в 1764 … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 41 фотографию.

18 января 1943 года Советская Армия прорвала блокаду Ленинграда, и в полосе прорыва железнодорожники в короткий срок построили железную дорогу Поляны – Шлиссельбург, а Ленинград получил прямое железнодорожное сообщение с Большой Землей. Впоследствии железнодорожный путь получил название — «Дорога Победы». … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 24 фотографии.

В Богословке мы уже бывали. Тогда было морозно и солнечно. Во второй раз был хмурый ноябрь. Но все равно посмотрим на этот музей под открытым небом. Музей современного деревянного зодчества. А когда-то здесь была усадьба. Появление усадьбы «Богословка» относится к … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 36 фотографий.

Побываем в декабре в Зеленогорске. Тем более, настоящяя зима, похоже, началась. Небольшой рыбацкий посёлок Териоки (швед. Terijoki, от искажённого фин. Tervajoki — Смоляная река) у места впадения Жемчужного ручья (реки Жемчужной) в Финский залив известен ещё с XVIII века. В … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 34 фотографии.

Начался январь Пора съездить в Карелию, в город Сегежу и посмотреть, как там зима. Надеемся, что посленовогодние дни не такие слякотные, как в Питере. Делаем остановку и убеждаемся, со снегом и морозом все в порядке. Вот и приехали. Сначала поглядим … Читать далее →

Другие галереи |

Эта галерея содержит 26 фотографий.

Пройдемся немного по Санкт-Петербургу в преддверии Нового года — 29 декабря. Метеорологи обещали небольшой мороз и снежок. Что может быть лучше для зимней прогулки. Однако все оказалось не таким радужным. Холодный, пронизывающий ветер с Невы. И скользкий, как каток, тротуар … Читать далее →

Другие галереи |

Где в кирилловском собирать грибы. Когда и где пойдут грибы в ленинградской области. Где собирать белые грибы, подосиновики и подберезовики

Грибы не теряют популярности. Для многих поход по грибы - способ провести выходные. В древности на Руси бытовало множество пословиц и поговорок, связанных с грибами:

«Кто раньше встанет - крепыши застанет, кто проспит восход - трухляки найдет», «Коль сбираешь грибы - смотри и на дубы. Чтоб не заблудиться вдруг, знай, где север, где юг». Правила, проверенные веками, ценители «тихой охоты» соблюдают и сегодня.

Но главное - правильно выбрать сезон. Он начинается в июле и продолжается до октября. Заядлые охотники бродят по лесам Ленинградской области и возвращаются с полными корзинами. Грибники считают: добычу можно найти в любом лесу, но верные места хранят в секрете. Попробуем раскрыть маршруты любителей «тихой охоты».

Для большей читабельности изображения, сохраните картинку на свой компьютер.

Грибные места Ленинградской области: куда поехать в выходной

Список грибных мест составлен на основе данных по нескольким предыдущим годам. В плане урожая грибов год на год не приходится, и портал Kolesa.Ru не имеет возможности с абсолютной точностью выяснить, какова ситуация во всех указанных местах на данный момент. Удачной охоты!

Новое Девяткино

Вкратце про место. Лес в районе Нового Девяткино – пожалуй, самое близкое к городу грибное место. Знающие люди до него ходят пешком от метро, и путь занимает у них не более 10 минут...

Район: Всеволожский.

Расстояние от города*: около 4 км от КАД.

Как доехать: съезд с КАД на Токсовское шоссе, далее – до Нового Девяткино.

Вероятность попасть в пробку по дороге: пробки в этом направлении бывают обычно по вечерам, а мы с вами знаем, что в это время настоящие грибники уже вовсю перебирают и чистят собранный урожай дома. Поэтому будем считать этот короткий путь практически беспробочным.

Бернгардовка

Вкратце про место. Еще одна возможность, отъехав совсем немного от города, вернуться с хорошими «трофеями».

Район: Всеволожский.

Расстояние от города*: около 5,5 км от КАД.

Как доехать: от улицы Коммуны по Рябовскому шоссе, далее – по Дороге жизни до окраины Всеволожска.

Вероятность попасть в пробку по дороге: последний раз пробка на Дороге жизни была зафиксирована с месяц назад – заторы на этом пути носят скорее эпизодический характер.

Семрино (ж/д. ст. «46-й км»)

Вкратце про место. Одно из самых «урожайных» (особенно – в сезон), но в месте с тем – и самых известных среди дачников грибных мест по Витебской ветке железной дороги.

Район: Гатчинский.

Как доехать: первый вариант – по Пулковскому и Киевскому шоссе до объездной дороги вокруг Гатчины, затем короткий участок по шоссе Н114, далее по трассе А120, затем по второстепенной дороге в сторону Семрино; второй вариант – через Пушкин, Павловск, Федоровское, Форносово по шоссе Н233, далее по трассе А120.

Вероятность попасть в пробку по дороге: если выбрать первый вариант проезда, встать можно на Киевском шоссе в районе Пулковских высот из-за строительства путепровода на Волхонском шоссе; если ехать по второму маршруту – можно застрять в Пушкине на Павловском шоссе, причем пробка с большой вероятностью будет тянуться до самого Павловска.

Пухолово

Вкратце про место. Имеется в виду лесной массив в окрестностях Мги между деревнями Войтолово и Сологубовка. Если же проехать от Пухолово до станции Турышкино и далее – в направлении Старой Малуксы, то там много болот, так что в сентябре туда смело можно ехать не только за грибами, но еще и за клюквой.

Район: Кировский.

Расстояние от города*: около 50 км от КАД.

Как доехать: от КАД – по Мурманскому шоссе до съезда на Кировск, далее – по шоссе вдоль Невы до Кировска, затем по шоссе А120 до Пухолово через Мгу.

Вероятность попасть в пробку по дороге: встать можно на Мурманском шоссе, на подъезде к ремонтируемому путепроводу в Разметелево.

Нурма

Вкратце про место. Хорошо известное питерским грибникам место, где есть самые разные виды грибов: от «солоновиков» (тех, что идут в засолку) до т. н. «благородных» (белых, подосиновиков и т. д.).

Район: Тосненский.

Расстояние от города*: около 50 км от КАД.

Как доехать: от КАД – по Московскому шоссе до Тосно, затем – по городу по Московскому шоссе и проспекту Ленина, с которого нужно повернуть налево на шоссе Бабырина; далее – по шоссе Р40 до Нурмы.

Вероятность попасть в пробку по дороге: на Московском шоссе практически в любой день недели можно «встать» в районе с/х Ленсоветовский, в Московской Славянке, перед поворотами на Пушкин и Колпино.

Синявино

Вкратце про место. Не очень далекое, но хорошее (в плане результата) место. Главный недостаток – большое количество грибников, особенно в сезон, так как Синявино – одно из самых крупных садоводств в данном районе области.

Район: Кировский.

Расстояние от города*: около 60 км.

Как доехать: от кольцевой – по Мурманской трассе до пос. Синявино.

Вероятность попасть в пробку по дороге: весьма высокая. Застрять (пусть не «глухо» и ненадолго) можно, прежде всего, в районе поселка Разметелево из-за ремонта путепровода, а также перед самим поселком Синявино – там, где Мурманское шоссе сужается с четырехполосной трассы до обычного загородного шоссе по одной полосе в каждом направлении.

Сосново

Вкратце про место. Одно из самых известных грибных мест в Приозерском районе, куда относительно просто добраться. Лесной массив весьма велик и богат на самые разные виды грибов. Правда, последствия прошлогоднего урагана несколько затрудняют подход к грибным местам – здесь очень много поваленных деревьев.

Район: Приозерский.

Расстояние от города*: около 60 км от КАД.

Как доехать: от КАД – про Выборгскому шоссе до поста ГИБДД, далее – по Приозерскому шоссе.

Вероятность попасть в пробку по дороге: встать можно уже на съезде с КАД: светофор у поста ГИБДД, как правило, собирает длинные «хвосты» во всех направлениях.

Озеро Зеркальное

Вкратце про место. Одно из самых грибных мест не только Выборгского района, но и всей Ленинградской области.

Район: Выборгский.

Как доехать: от КАД – по Приморскому шоссе через Сестрорецк, Зеленогорск, Песочное, до Зеленой Рощи, далее – по второстепенным дорогам через ж/д. ст. Яппиля до озера.

Вероятность попасть в пробку по дороге: от Сестрорецка до Зеленогорска можно ехать по «верхнему» или по «нижнему» шоссе, наиболее «быстрым» является первое. Пробки часто бывают на обратном пути в месте примыкания обеих трасс к Приморскому шоссе.

Лаврово/Кобона

Вкратце про место. Весьма большой лесной массив, причем крупных садоводств поблизости нет. Кроме того, эти места – исторические: именно через Лаврово и Кобону в блокадный Ленинград возили хлеб и продовольствие по Дороге жизни.

Район: Кировский.

Расстояние от города*: около 70 км от КАД.

Как доехать: от КАД – по Мурманскому шоссе до деревни Дусьево, затем – 10 км по второстепенным дорогам до Лаврово.

Новая Деревня / Кипуя

Вкратце про место. Огромный лесной массив, тянущийся практически от самого Мурманского шоссе до Ладожского озера. Много болот. Ураган в прошлом году прошелся и по этим местам, но лес пострадал лишь частично.

Район: Волховский.

Расстояние от города*: около 80 км от КАД.

Как доехать: от КАД – по Мурманскому шоссе до указателя «Кипуя», далее – по второстепенным дорогам.

Вероятность попасть в пробку по дороге: весьма высока. Самые «пробочные» места – перед путепроводом в Разметелево, перед Синявино. Плотное движение – перед мостом через реку Сарья в Дусьево.

Грибным сезоном в лесах под Санкт-Петербургом считается время с августа по ноябрь, но съедобные грибы можно найти Ленинградской области практически круглый год. Ориентируйтесь на приведенный ниже календарь грибника - он охватывает самые популярные из произрастающих в лесах Ленинградской области более чем 200 видов съедобных грибов.

Календарь грибника для Ленинградской области
Месяц сбора Виды грибов Особенности сбора
Январь Вешенка Для грибников самый пустой месяц, в лесу искать практически нечего. Но если зима выдалась теплая, можно обнаружить свежие вешенки. Они обычно растут на деревьях, шляпка такого гриба однобокая или округлая, пластинки сбегают на ножку, как бы прирастая к ней.Отличить вешенку от несъедобных грибов несложно - она имеет совершенно некожистую на ощупь шляпку.
Февраль Вешенка, древесные грибы Если не наступила оттепель, искать в лесу практически нечего
Март Вешенка, древесные грибы, говорушка Грибов практически нет, зато в конце месяца могут появиться первые подснежники.
Апрель Вешенка, древесные грибы, говорушка, сморчок, строчок Достаточно часто встречаются грибы-подснежники – сморчки и строчки
Май Сморчок, строчок, масленок, вешенка, дождевик Больше всего грибов можно найти не под деревьями, а на полянах, в густой траве.
Июнь Масленок, подберезовик, подосиновик, вешенка, сморчок, опенок, лисичка, белый гриб, дождевик В июне начинают появляться грибы высшей (первой) категории.
Июль Масленок, подберезовик, подосиновик, вешенка, сморчок, дождевик, опенок, лисичка, белый гриб, моховик Грибов уже достаточно много – и на полянах, и под деревьями. Кроме грибов уже встречается земляника и черника.
Август Масленок, подберезовик, подосиновик, вешенка, сморчок, опенок, лисичка, белый гриб, моховик В это время грибы можно найти практически везде: в траве, под деревьями, возле пней, в канавах и на деревьях и даже в городских скверах и на обочинах автодорог. Кроме грибов уже созрела брусника, а на болотах появляется клюква.
Сентябрь Масленок, подберезовик, подосиновик, вешенка, сморчок, опенок, лисичка, белый гриб, моховик. Сентябрь самый урожайный грибной месяц. Но нужно быть внимательным: в леса приходит осень, а в яркой листве трудно разглядеть разноцветные шляпки грибов.
Октябрь Валуй, вешенка, рыжик, опенок, шампиньон, подосиновик, белый гриб, груздь, моховик, сыроежка Число грибов на полянах начинает уменьшаться. В октябре искать грибы лучше возле пней и под деревьями.
Ноябрь Масленок, зеленушка, вешенка, древесные грибы. Начинаются заморозки, и велика вероятность найти подмороженные грибы.
Декабрь Вешенка, древесные грибы Грибов почти уже и нет – но если повезет, то можно найти остатки от осеннего изобилия

Информация о том, куда поехать за грибами в августе 2018 года в Ленинградской области.

Знаете, как пахнет лес? Он пахнет воздухом! Тем, которого в городе днем с огнем не сыщешь. А еще он пахнет грибами. В сезон. Который сейчас, собственно, вовсю набирает обороты. Мы, к сожалению, не имеем ежедневной возможности поехать за грибами, хоть и знаем куда (имеется в виду не только Ленинградская область, но и Карелия, и Псковщина, и даже ). С самого детства помню, как рано утром (скорее, поздней ночью) меня, полусонную, складировали в машину, в багажник загружали корзинки и пропитание и везли куда-нибудь подальше. На весь день. Поэтому я знаю все места, куда поехать за грибами в Ленинградской области в конце лета и осенью. И без сожаления эти места сейчас спалим.

(Фото грибочков стырено с интернета, потому что мы грибы собираем, а фотографировать забываем))))). Если хозяин найдется, укажем ФИО)


Грибные места Кировского района

Отрадное. Там только-только пошли боровики. К следующим выходным вылезут окончательно. Информация проверена друзьями-приятелями.

Войтолово и Сологубовка (примерно 50 км от кольцевой). Там более чем отличный лес. Хорош он еще и тем, что в нем есть болота, на который осенью растет клюква.

Синявино. Хорошее грибное место Ленинградской области, но слишком популярное. Сюда и на электричках ездят и на машинах. И местных дачников хватает. Так что, если думаете, куда поехать за грибами и решите отправиться в эту часть Ленинградской области – вставайте пораньше.

На взгляд наших друзей, самое лучшее грибное место Кировского района Ленинградской области – Лаврово. Немного дальше Синявино, зато здесь нет садоводств и, как следствие, отметается часть грибников.

Грибные места в Приозерского района

Самое первое, что приходит в голову при мысли о грибных местах Приозерского района – Сосново. Приходит в голову это грибное место не только нам, а всем, кто ходит на охоту за грибами в Ленинградской области. Грибов здесь много, но крайне малое их количество успевает вырасти. Срезают еще в зачаточном состоянии.

Грибные места Выборгского района

АХТУНГ! Август 2018 года — белые и подберезовики в большом количестве в Каменке на полигоне! Все едем туда! Ну и лисички там тоже в большом количестве лезут.

Выборгский район богат на грибные места. У Кеши там дача в садоводстве в лесу, и порой стоит выйти за калитку, как можно найти несколько «благородных». Поэтому частенько вообще не стоит вопрос «куда поехать за грибами в Ленинградской области» — мы просто едем на дачу. А дача у нас в Яппиля.

В 5 км от Яппиля еще одно известное грибное место Выборгского района – озеро Зеркальное. Вот уж точно, если решать, куда поехать за грибами в Ленинградской области так, чтобы вернуться с полной корзиной – Зеркальное будет беспроигрышным вариантом.

Танковый полигон Каменка. Грибов много, но – постреливают. Хотя о стрельбах предупреждают заранее.

Первомайское. . Наше любимое грибное место Ленинградской области. Позавчера набрали целое ведро моховиков и боровиков при том, что гуляли медленно и с ребенком. Ребенок сам находил белые и страшно радовался. И черники с брусникой на удивление много.

Грибные места Всеволожского района

Агалатово. Правда, там, по отзывам, в этом сезоне больше грибников, чем грибов. В том смысле, что грибов много, но тех, кто нашел неправильный ответ на вопрос «куда поехать за грибами в Ленинградской области» — еще больше. Так что подумайте сто раз. Ехать не далеко, но стоит ли постоянно здороваться с соперниками?

В Бернгардовке тоже есть чем поживиться. И, на удивление, народу меньше, чем в Агалатово.

Пери и Мельничный ручей. Тоже неплохо и недалеко.

P.S. И выезжайте пораньше, чтобы не встать в пробку. Желающих поехать к грибным местам Ленинградской области очень много!

Поиск авиабилетов:

Лучшие предложения от авиакомпаний ->>

Поиск отелей по всему миру:

Подберите отель сейчас и сэкономьте ->>

Планируйте заранее: Не забудьте про страховку:

Принято считать, что идеальным временем для сбора грибов выступает лето и осень. Это обосновывается появлением именно в этот сезон большого грибного изобилия. Более опытные грибники уже заранее наметили, так сказать, плодоносные места в лесах.

Какие грибы распространены в лесах Ленинградской области

Они формируют следующий перечень:

Где много грибов в Ленинградской области

Их весьма существенное количество наблюдается в поселке Сосново, расположенном в центральной части леса, в котором преимущественно хвойные деревья. Там можно встретить различные виды грибов, но наиболее распространены, такие как красные и желтые сыроежки, черные грузди, горькушки и лисички. Подосиновики и белые грибы в Ленинградской области также можно отыскать, если сезон выдался дождливым. Добраться до этого поселка из Санкт-Петербурга можно на электричке, которая отправляется с Финского вокзала.

Также у заядлых грибников популярно такое место, как ж/д станция «Бернгардовка», точнее ее окрестные леса.

Если хочется узнать, где много грибов в Ленинградской области, то стоит обратить внимание на такой поселок в хвойных лесах, как Снегиревка. Там достаточно много лисичек, моховиков, сыроежек, подгруздков, а реже и подосиновиков с белыми грибами. Чтобы до него добраться, сначала придется доехать на электричке до ранее упомянутого поселка Сосново, а там уже автобусом - до нужного места.

Неподалеку от простирается еще один грибной поселок, который носит название Лосево. До него также ходит электричка с Финского вокзала. Здесь растут грибы, маслята, а если год урожайный, то и лисички.

Белые грибы в Ленинградской области (поселок Стекольный) в изобилии практически каждый год соответствующего сезона. Однако главной трудностью выступает то, как туда добраться. Доехать в эти места можно исключительно на автомобиле.

Что нужно знать о грибах

  • Первое, что стоит запомнить тем, кто намерен заняться плодотворной «тихой охотой», - грибы чаще всего растут группами, поэтому стоит повнимательнее посмотреть вблизи уже найденного экземпляра.
  • Второй момент - не стоит собирать подозрительные, прогнившие либо незнакомые вам грибы.
  • И третье - складывать их следует в корзину или лукошко, ввиду того что они способны лучше всего обеспечить требуемую для сохранности грибов циркуляцию воздуха.

Когда же лучше всего отправиться в лес

Сезон грибов в Ленинградской области укладывается в период с начала лета до середины осени. В сентябре на смену летнему урожаю пришли осенние грибы. Сейчас в лесу их ценителям будут доступны поляны опят, свинушек, волнушек, белянок, подберезовиков, подгруздков и т. д.

К сожалению, октябрь выступает последним месяцем грибного сезона, однако поздние опята, последние волнушки, белянки и рыжики могут еще порадовать всех своих поклонников.

К чему может привести сбор грибов в Ленинградской области неподготовленными любителями

По имеющимся официальным данным, 10 сентября 2014 года в реанимации отделения токсикологии НИИ скорой помощи им. Джанелидзе оказались трое петербуржцев, которые отравились ядовитыми грибами, собранными во Всеволожском и Тосненском районах Ленинградской области.

По словам заведующего вышеуказанным отделением Олега Кузнецова, точно установить разновидность гриба, послужившего причиной отравления, очень сложно. Предположительно, это могла быть (самый ядовитый гриб).

С начала сезона «тихой охоты» в Санкт-Петербурге это уже по счету шестой случай отравления. В августе поступили первые жертвы — одна женщина и двое мужчин. По словам того же заведующего, на сегодняшний день два пациента были переведены из реанимации, а один пострадавший все еще в тяжелом состоянии.

Таким образом, следует учитывать, что в Ленинградской области «пошли грибы» не только съедобные, но и ядовитые. Необходимо тщательнее подходить к вопросу выбора пригодного для еды экземпляра.

Какие грибы уродились в начале этого сезона в Ленинградской области

Летними представителями, принявшими эстафету у майских строчков и сморчков, стали первые опята. Отыскать их можно было на бревнах, гнилушках и пнях лиственных пород. Грибы Ленинградской области в июне, исходя из их количественной составляющей, были представлены преимущественно опятами.

Также в первый месяц лета можно было встретить так называемые грибы-колосовики. Это название является не научным, а народным. С давних времен было замечено, что самые востребованные грибы начинают появляться к сенокосу и колошению ржи. Отсюда и произошло их название - сенокосники или колосовики.

Их официальное наименование - подберезовики, подосиновики, белые грибы и «грибной царь» - боровик. Они выступают, без преувеличения, главной целью истинных грибников. В связи с этим существует поверье: пока не будет найден первый белый гриб, сезон не считается открытым.

Что собой представляют и где встречаются белые грибы

Они имеют такое название в связи с тем, что трубчатый слой нижней поверхности их шляпки преимущественно у молодых представителей остается белым даже после сушки, в отличие от других грибов данного семейства, у которых он чернеет.

Одним из параметров их ценности является стойкость аромата, который сохраняется в любом виде обработки и в любом блюде. По вкусовым и питательным свойствам, содержанию витаминов именно белый гриб занимает лидирующие позиции среди всех остальных своих коллег. Он относится к 1-й категории и используется в пищу как в свежем, так и в сушеном, соленом и маринованном виде.

В нем обнаружены антибиотики, угнетающие Также имеются официальные данные того, что белые грибы содержат и вещества, способные побороть ряд опухолей.

Они чаще всего сконцентрированы в сосновом бору. Исходя из многолетнего опыта знающих грибников, сезон их начинается в последней декаде августа и растягивается приблизительно до 10 дней. После указанного периода белые грибы еще можно встретить, однако лишь в небольшом количестве, порядка десяти штучек.

Белые грибы в Ленинградской области преимущественно обитают в таких местах, как Кирилловское, Яппиля, Местерьярви, Заходское, Гаврилово, Тарасовское, Алеховщина и полигон под Лугой.

Отличительные черты бледной поганки

Неопытные грибники довольно часто принимают ее за шампиньон или зеленую сыроежку. Поэтому стоит выделить три основных отличия между ними:

  1. У бледной поганки всегда присутствует утолщение в нижней части ножки, а у вышеуказанных грибов его нет.
  2. Ее пластинки на шляпке с внутренней стороны абсолютно белые, а у шампиньона - розовые.
  3. Ножка бледной поганки имеет пленчатое кольцо, расположенное немного ниже шляпки.

Стоит обзавестись правилом: «Собираем грибы в Ленинградской области и всегда помним об этих вышеуказанных различиях, а если есть сомнение, то лучше этот экземпляр не брать!»

Где искать подберезовики в Ленинградской области

По мнению опытных грибников, они любят такие места, как болота, а также местность, на которой растет большое количество берез. Даже если они посреди возле них подберезовики растут обязательно. Появляются данные грибы в самом начале лета и изобилуют до конца сезона.

Если встает вопрос о том, где много грибов в Ленинградской области, в частности подберезовиков, то можно смело озвучить такие места, как Кирилловское, дорога на Каменку и окрестные территории поселка Ягодное. Более того, грибы в этих местах прошли лабораторные исследования, по результатам которых было выявлено в десятки раз меньшее количество вредных веществ, чем установлено по норме.

Богата ли подосиновиками Ленинградская область

Среди трубчатой разновидности после ранее рассмотренного белого занимает почетное второе место, исходя из критерия пищевой ценности (вторая категория). Его употребляют как в вареном виде, так и в жареном, маринованном и сушеном. Он признается самым быстрорастущим грибом.

Данные грибы в Ленинградской области распространены так же, как и подберезовики. Они являются наиболее часто встречаемыми и узнаваемыми съедобными грибами. Их главным преимуществом выступает то, что подосиновики нельзя спутать ни с одним другим грибом, в том числе и ядовитым. Все же дряблые экземпляры лучше не собирать, ввиду того что они сгниют еще в корзине.

По многолетним сведениям опытных грибников, можно выделить места, где много грибов в Ленинградской области, а именно подосиновиков. К ним относятся: Мшинская, Каннельярви, Сосново, Кузнечное, Вырица, Рощино, Горьковское, Приозерск и Лосево.


Фото: visitkamchatka.ru

Темы дня

    У каждого грибника, как правило, есть свое особенное место, куда он ходит собирать лесное лакомство. "Санкт-Петербург.ру" рассекречивает грибные места в Ленинградской области.

    Начался сезон тихой охоты. У каждого грибника, как правило, есть свое особенное место, куда он ходит собирать лесное лакомство из года в год. И такие места всегда держатся в строжайшей тайне. Однако, все тайное рано или поздно становится явным. Руководствуясь этим правилом, "Санкт-Петербург.ру" рассекречивает грибные места в Ленинградской области.

    Санкт-Петербург.ру обновил информацию по местам сбора грибов в Ленобласти - актуальная на 2016 год информация по ССЫЛКЕ

    Где искать грибы:

    Поселок Сосново славится тем, что местные жители умудряются собирать грибы, выходя погулять с собакой или выкинуть мусор. В общем-то и не удивительно, так как поселок находится практически посередине леса. Сосновские леса относительно сухие, смешанные, с преобладанием ели и, конечно, сосны. Практически везде вокруг Сосново собирают самые разные грибы - очень уж большая территория Сосновского сельского поселения. Охотники за осенним лакомством отмечают обилие черных груздей, красных и желтых сыроежек, часто встречаются лисички и горькушки. В сезон и удачный год собирают и белые грибы, и подосиновики. Доехать до Сосново можно на электричке от Финляндского вокзала.

    По отзывам грибников, набрать полную корзинку грибов можно и в районе железнодорожной станции Бернгардовка . Правда, идти от станции до леса придется около получаса. Доехать до Бернгардовки также можно на электричке, отправляющейся от Финляндского вокзала.

    Леса поселка Снегиревка (рядом с Сосново) - смешанные с преобладанием хвойных деревьев - удивят любого грибника разнообразием грибов. Растет здесь почти все - лисички, подгруздки, моховики и вездесущие сыроежки. Также здесь вполне можно насобирать и боровики, и подосиновики. Добираться удобно на электричке до Сосново, а дальше на рейсовом автобусе.

    Еще один поселок славится своими грибными месторождениями. В лесу возле поселка Лосево , что рядом с рекой Вуокса, попадаются белые грибы, подосиновики, подберезовики, масленки и моховики, в сезон и лисичек можно набрать. Однако здесь придется посоревноваться в скорости нахождения грибов с другими многочисленными "охотниками". Добраться до Лосево можно на машине или на электричке от Финляндского вокзала до станции Лосево или автобусом от Сосново.

    Некоторые грибники советуют собирать осенние дары леса только под Стекольным поселком. Говорят, что в сезон там можно набрать много белых грибов. Однако добраться до этого места можно только на машине.

    Леса между поселками Борисово и Мичуринское в Приозерском районе характеризуются примерно одной "продукцией". Здесь много черных груздей и лисичек. Реже встречаются и благородные белые, подосиновики и подберезовики. Кроме грибов, тут собирают чернику, встречаются брусника и клюква. Добраться можно на автобусе из Сосново.

    На Карельском перешейке благородные грибы, по словам бывалых собирателей, встречаются на каждом шагу.

    Леса восточнее станции Мюллюпельто (район, ограниченный поселками Солнечное, Моторное и Починок, 10-15 км юго-восточнее Приозерска) также славятся разнообразными грибами. Это, по мнению грибников, одно из самых урожайных мест. Добираться сложно, поэтому лучше ехать на машине.

    На островах в районе поселка Кузнечное чаще всего можно встретить лисички. Хотя добираться туда конечно не просто, тут и машина нужна, и водный транспорт требуется.

    А вот до леса возле поселка Новое Девяткино добраться проще всего - 10-15 минут пешком от cтанции метро "Девяткино". Правда, лес здесь очень влажный. С августа по октябрь, в сезон, около Нового Девяткино можно найти даже белые грибы.

    Лес под Выборгом , наоборот, очень сухой. Поэтому в августе — октябре здесь начинается настоящий урожай подосиновиков, подберезовиков и белых грибов. Добраться можно на машине или на электричке от Финляндского вокзала или же на автобусе от метро "Гражданский проспект".

    И последнее известное нам грибное место - лес возле поселка Синявино в Кировском районе . Грибы здесь можно встретить любые — от маслят и сыроежек до белых. Есть в этом лесу одно "но": в период Великой Отечественной войны здесь шли ожесточенные бои, поэтому остались воронки, в которые легко можно провалиться. Добраться можно и без машины, на автобусе от метро "Улица Дыбенко".

    На заметку:
    - Большинство людей считает, что грибы надо искать подальше. Отчасти это верно. Однако, чаще всего именно в тех местах, где никто не ищет, грибы и растут.

    Грибы никогда не растут по одному. Если вы что-то высмотрели, обязательно тут же остановитесь и посмотрите себе под ноги. Там наверняка кто-то спрятался.

    Не знаете, что за гриб - не берите. При любом малейшем подозрении лучше просто оставить гриб в лесу. Помните, жизнь дороже.

    Лучше всего грибы собирать в корзины из ивовых прутьев или в лукошки из бересты. В целлофановых мешках и ведрах они быстро портятся из-за отсутствия обмена воздуха.

    Ни в коем случае не берите уже подгнившие грибы. Даже если гнилую часть удалить, вкусовые и полезные качества гриба могут пострадать.

    Перезревшие и мягкие грибы, а также червивые тоже брать не стоит.

    Легенды о грибах:

    Говорят, что грибы в лесу не просто так живут. Их комары разводят. Чтобы люди сами приходили к ним домой.

    Считается, что лягушки могут вывести к грибам. Особенно самые маленькие. Пойдите за лягушонком и рано или поздно выйдете к подберезовику или какому-нибудь другому грибу.

    Какие грибы растут в лесах Ленобласти:

    Масленок. Свое название получил из-за маслянистой, скользкой на ощупь шляпки. Характерными признаками, отличающими большинство видов маслят от других грибов этого вида, является клейкая слизистая, легко снимающаяся кожица шляпки и кольцо.
    #imglib#7136#c

    Подберезовик . Часто растет по краям лесных дорог. Шляпка до 15 см в диаметре, полушаровидная, позднее подушечковидная, голая или тонковойлочная, сухая, в сырую погоду чуть слизистая. Цвет гриба может варьироваться от светло - серого до темно-бурого.
    #imglib#7132#c

    Подосиновик. Встречается часто со второй половины июня до октября. Растет большими колониями. Шляпка у гриба до 25 см в диаметре, вначале колпаковидная с прижатыми к ножке краями, позднее подушковидно-выпуклая. Цвет шапки гриба также может быть ярко-красныым, оранжевым, серым, белым. Мякоть белая, плотная, толстая, на разрезе краснеющая, зеленеющая и, наконец, чернеющая.
    #imglib#7134#c

    Опенок. Растет большими группами с конца августа до поздней осени на пнях, корнях, валежных и живых стволах лиственных, главным образом березовых, реже хвойных деревьев, иногда в зарослях крапивы. Шляпки диаметром до 13 см, у молодых грибов шаровидная, с загнутым внутрь краем, затем плоско-выпуклая с бугорком в центре. Цвет шляпки - серо-желтый, желто-коричневый с оттенками, в центре более темный, с тонкими мелкими, иногда отсутствующими коричневыми чешуйками.
    #imglib#7135#c

    Белый гриб. Считается царем грибов не только из-за его внушительного размера, но и благодаря его вкусу и питательности. Другое название белого гриба — боровик, реже — коровка. Белый гриб может достигать огромных размеров — шляпки до 50 см в диаметре и ножки до 25 см в высоту.
    #imglib#7138#c

    Моховик. Относится к роду трубчатых грибов и растет с начала лета до осени в хвойных, лиственных и смешанных лесах одиночно или небольшими группами. Шляпка полушаровидная, со временем становится выпуклой, а затем плоской. Сверху она бархатистая, темно-зеленого или коричневого-бурого цвета, губчатый слой ярко-желтый.
    #imglib#7137#c

    Все новости рубрики

Кира Столетова

Грибные полянки, расположенные у автомагистралей и заводских мусорок непригодны для сбора грибов. Грибы Ленинградской области в большом количестве появляются в лесных массивах, расположенных вблизи Санкт-Петербурга.

Грибные места

Грибы в Ленинградской области сейчас собирать опасно из-за большого количества дорог и множества заводов, сбрасывающих свои отходы в реки. Под действием токсинов грибы накапливают галлюциногенные вещества, которые плохо влияют на нервную систему, поэтому места для сбора подбирают с особой тщательностью.

Координаты грибных мест:

  1. Сосновый бор – Приозерский район по направлению Выборгского шоссе.
  2. Сосновый массив – поселок Сосново. С Финского вокзала в поселок ходит электричка из Санкт-Петербурга.
  3. По Скандинавии свернув на селение Кирилловское, вы найдете отличные лесные массивы, полные грибов. Туда едет электричка.
  4. Проехав Всеволожский район, вы найдете Сосновый бор. Расстояние между населенными пунктами - 118 км. Более точное местоположение поможет определить атлас с названиями поселков.
  5. На юге от озера Лужского района расположен лесной массив. Его несложно отыскать на карте.
  6. До поселения Заходское ходит электричка. Это место идеально подходит для сбора съедобных грибов.

Грибные места Ленинградской области представлены сосновыми и смешанными лесами. Почва торфяно-песчаная. Много грибов в Ленинградской области появляется осенью, в сентябре, весной и летом их меньше. Рядом с озером Зеркальное расположены самые чистые сосновые леса. Более подробные описания с координатами грибных мест в Ленобласти можете узнать, посетив клуб грибников СПБ.

Если в Ленинградской области пошли грибы, стоит быть особенно внимательным к тому, чтобы не принять ядовитых двойников за съедобных представителей.

Описание грибов региона

Грибники в Ленинградской области собирают следующие виды съедобных грибов: Сморчок, Белый, Трюфели, Вешенки, Веселка, Лисички, Маслята, Подосиновики, Опята.

Несъедобные галлюцегенные виды: Псилоцибиновые разновидности, Поганки, Ложные опята, Мухоморы, Шампиньон желтеющий, Строчок.

Сморчок

Первые весенние съедобные грибы – Сморчки. Селятся в лесах смешанного типа в апреле-мае. Шляпка гриба конической формы, сморщенная.

Длина ножки до 10 см. Цвет белый. По вкусовым данным уступает только белым грибам и подосиновикам. Используется гриб для приготовления различных кулинарных изысков.

Белый гриб

Белые грибы в Ленинградской области собирают с июля по сентябрь. Они растут в сосновом лесу, на песчаниках. Форма шляпки округлая. Цвет серый, ножка плотная, толстая.

Определить съедобность гриба можно по приятному аромату. У ложного белого гриба или поганки – серно-кислый запах. Белые грибы пойдут для приготовления любых кулинарных блюд, соления, маринования, но особенно хороши в сушеном виде.

Трюфели

Ленинградская область - один из немногих регионов, в которых растет белый трюфель. Чтобы пособирать его, понадобится свинья или собака.

Сбор Трюфелей усложнен их подземным происхождением. Они растут на глубине 15 см, поэтому искать их сложно. Всегда запоминайте место, где были выкопаны Трюфели, на следующий год они снова там вырастут. Места распространения этого вида держат в секрете, т. к. котомка подземных грибов может принести доход, равный среднемесячной зарплате.

По внешнему виду Трюфель напоминает сморщенное яблоко или айву белого цвета. Шарик имеет плотную структуру.

Вешенки

Сезон сбора вешенок начинается в сентябре и продолжается до самых заморозков. Съедобные грибы получили высокую оценку за низкокалорийность. Шляпка загнута по краям, по форме напоминает раковину, диаметр взрослого экземпляра достигает 25 см. Цвет от молочного до фиолетового. Ножка тонкая, высотой 2-3 см.

Мякоть сочная, плотной структуры. Произрастает на омертвевших деревьях и пнях. Подходят для приготовления закусок, первых блюд и гарниров.

Веселка

Растет одиночно в смешанных и хвойных лесах. Пик плодоносности наступает в августе. Грибница на одном месте не формируется несколько лет.

Используется для изготовления лекарственных средств от самых разных заболеваний. Находят его по гнилостному запаху. Шляпка и ножка покрыты слизью. Самым ценным считается гриб, наполненный изнутри желеобразной жидкостью.

Лисички

Деликатесные съедобные грибы. Поверхность шляпки выпуклая, по краям волны, завернута к ножке. Чем старше экземпляр, тем больше форма шляпки начинает напоминать воронку. Мякоть уплотненной структуры, не ломкая. Обладает приятным ароматом и высокими вкусовыми качествами.

Любят сосновые леса. Мицелии формируются в начале лета, растут до середины октября. Искать их стоит на открытых участках, под травой и листьями. Используются для приготовления солений, разных кулинарных блюд. Главное достоинство, которое ценят грибники в лисичках – они не червивеют.

Маслята

Грибы распространены в смешанных и хвойных лесах. Если вы нашли один, значит, где-то поблизости расположена целая группа. Шляпка гриба полуконической формы, около 15 см в диаметре. Покрыта маслянистой кожицей коричневого цвета.

Ножка плотная, около 8 см. Окрашена в белый оттенок. Мякоть плотной структуры, губковидная. Обладает приятным ароматом хвои. Используют продукт для жарки, варки, соления и сушки. Сезон плодоношения начинается в мае-июне, заканчивается в сентябре-октябре.

Подосиновики

Название говорит о месте обитания гриба. Шляпка полушаровидная, яркого оранжево-коричневого цвета. У взрослых экземпляров диаметр шляпки достигает 30 см. В Сосново можно собрать 10-20 кг подосиновиков.

Ножка плотная, крупная, покрыта мелкими коричневыми чешуйками. Мякоть волокнистой структуры. Относится к универсальным продуктам в отношении использования. В жареном виде на вкус напоминает мясо.

Опята

Обладают приятным вкусом и ароматом. Селятся на пеньках. Шляпка выпуклая, с возрастом край становится волнистым. Средний размер 12 см.

Ножка имеет волокнистую структуру. Тонкая, длинная – 10 см, в верхней части расширена. Мякоть белая, волокнистая. Осенние маслята активно плодоносят весь сентябрь.

Цвет шляпки зависит от типа древесины, на которой поселился гриб. Акация или тополь дают медово-желтые тона. Дуб – красный, а хвойный валежник – коричнево-красный.

Ядовитые грибы

Псилоцибе насчитывает около 150 видов. Ядовитые грибы, оказывающие галюциногенный эффект. При первом употреблении явных последствий не наблюдается. Длительное систематическое потребление этих грибов вызывает стойкое нарушение психики.

Растут на пеньках и рядом с ними. Шляпка конусовидная, ножка тонкая. Окрашены в серый цвет. Поганки появляются самыми первыми. Если хотите собрать много грибов, ориентируйтесь на их местоположение, рядом обязательно будут расти съедобные виды. Шляпка поганки конусовидная, розового цвета.

Мухоморы обитают в лесах любого типа, ядовитые. Их ни с чем не спутать. На красных головках отчетливо выступают белые точки. Ножка высокая белая. Место поселения ядовитых опят аналогично съедобным собратьям. Ножки тонкие, полые, шляпки яркого цвета. Кожура гладкая.

Шампиньоны желтеющие – ядовитые грибы. Шляпка белая, становится ярко-желтой при сдавливании. Употребление этой разновидности приводит к серьезным отравлениям. При головокружении, рвоте, потере сознания, сразу же отправляйтесь на прием к врачу.

Строчки – ядовитые двойники сморчков. Их шляпка бесформенная, сморщенная, приросшая к ножке по всей длине. Мякоть светлая, хрупкая, без ярко выраженного запаха. Сезон повышенной плодоноскости начинается параллельно со сморчками.

Сентябрь 2017 года, а грибы в Ленобласти только - только пошли...

Грибники (Грибы Ленинградской Области 2017, Приозерский район) 1 серия

Грибы в северной Карелии. silent hunting

Заключение

Сбор грибов в Ленинградской области начинается весной. Чтобы поездка за грибочками прошла успешно, обзаведитесь справочником с названиями съедобных и несъедобных видов, а также учитывайте все советы, написанные выше.

для души, Точка зрения: IVBG.ru

Электрички переполнены любителями собирать грибы, которые едут за «урожаем» в Выборгский район. А выборжцы собираются в более южные леса: в социальных сетях обсуждают неурожай на грибы в Выборгском районе и места наибольшего «улова».

Утренние электрички везут в сторону Выборга грибников. Об этом сегодня на рассвете в группе «Привет, сей час» сообщил пост Михаила Агафонова.

Сей час 7:25. За бортом утро пятницы, и мы везём толпу грибников в сторону Выборга. На фотографиях соседние станции Парголово и Левашово Октябрьской магистрали,– пишет Михаил Агафонов из кабины машиниста электропоезда на странице сообщества ВКонтакте.

Вот только если верить комментариям других пользователей той же соцсети ВКонтакте, большого улова в наших краях любителям тихой охоты ожидать не стоит.

На свой вопрос о наиболее удачном направлении для грибной охоты под Выборгом пользователь ВКонтакте под ником Максим Евгеньевич получил неоптимистичный прогноз.

Некоторые грибники, отчаявшись дождаться грибов в Выборгском районе, отправляются на юг Ленобласти. Так, например, пользователь под ником Елена Атаманова, находящаяся на 33 неделе беременности, говорит, что не сможет нормально родить пока не съездит за грибами, поэтому узнает расположение грибных мест в других районах.

Неурожай на грибы в нашем районе связывают с поздним приходом осени.

Находятся и удачливые грибники, они охотно делятся фото своих трофеев и примерно называют места, где они их нашли.

О том, что грибы в наших лесах все-таки есть, говорит и народная «примета», согласно которой наличие грибов в лесу можно определить по их продаже на улице.

Так что у всех, кто собрался на тихую охоту в наших лесах есть надежда.

Кстати,  если верить записи сообщества «Грибы Ленинградской Области Санкт-Петербурга СПБ» ВКонтакте, традиционные грибные места в Выборгском районе находятся в Гаврилово, Ермилово, Заходском, Кирилловском, Рябово и Яппиля.

В какие места в Ленобласти самое время за грибами ходить

Где сейчас в Ленобласти грибов много, а где - не очень

Грибы в Ленинградской области этим летом еще пошли - местами неожиданно рано. Но вот сейчас, в эти дни - классическое начало сезона грибной охоты. В какие места имеет смысл за грибами отправляться, а куда - не стоит? Оnline47 изучил отзывы самих "тихих охотников" в сети.

Сосновый Бор

Грибники из Соснового Бора и окрестностей говорят, что грибов в округе много - в любую сторону от города, но - плюс еще пять километров от садоводств:

И этой рекомендации стоит верить: вот они, фотофакты удачной охоты от Анастасии Яковлевой. Охотница еще и рассказывает: группами, мол, грибы-то ходят: "Грибы идут стройными рядами"....

Анастасия Яковлева/ВК

Анастасия Яковлева/ВК

А Александра Ефимец из того же Соснового Бора поделилась фотографией гриба-великана, причём, чистого и здорового:

Александра Ефимец/ВК

Тосно

Есть грибы и в Тосненском районе, только всё больше подосиновики, и изредка - подберезовики. Во всяком случае, так утверждает Владимир Авдеев, и тоже доказывает сказанное фотографиями:

Владимир Авдеев/ВК

Владимир Авдеев/ВК

Пикалёво

В лесах под Пикалёво рыжики растут - да какие! "Славик Григорьев" вон их сколько собрал:

Славик Григорьев/ВК

Выборгский район

В Выборгском районе грибы тоже есть - только надо знать, куда ходить. Вот сколько за час набрал Дмитрий Мензер в окрестностях Пушного:

А вот что нашла Валентина сегодня в районе Пески - 29 км:

Валентина Калистратова(Скворцова)/ВК

Она, кстати, всем желает "удачной грибалки" и даже место указывает - куда идти:

А вот в Кирилловском направлении как-то всё. .. по-грибному грустно. Люди пишут, что в окрестностях Каменки на 2-3 километра от дороги в лес - ни одного гриба: "Даже поганок нет... болота сухие!".

Гатчина

А вот Виктория Бардина без всяких комментариев опубликовала портрет гриба, выросшего в лесах у Кобралово Гатчинского района. И вот кто как, а в Оnline47 считают, что именно он - безусловный победитель конкурса грибной красоты:

Виктория Бардина/ВК

Конечно, Ленинградская область большая, и потаённых грибных мест в ней много - а сезон только начинается. Так что рассказ о том, куда за какими грибами идти, будет продолжен.

Продолжение следует...

Грибы поперли!

В Ленинградской области активно стартовал грибной сезон-2016.

Петербурженка Ольга Пантелеевна выложила на своей страничке в соцсети фото 126 подосиновиков – итог ее поездки за город на минувших выходных. «Зачем работу?!» – сразу же прокомментировал другой пользователь интернета Андрей Бухаров, призывая всех, бросив дела, отправиться на «тихую охоту». Но – стоп! Не зная гриба, не суйся в лес – можно и отравиться. Сегодня мы расскажем о самых распространенных в это время в нашем регионе грибах, о грибных местах и о том, как остаться в живых после прогулки с корзинкой.

ГРИБЫ ВЗЯЛИ РЕВАНШ ЗА ПРОШЛЫЙ ГОД

Если 2015 год был самым не грибным за предыдущие 25 лет, то уже сейчас понятно – нынешнему грибному сезону такой антирекорд не грозит.

«Грибов в лесах уже выросло больше, чем в те же дни прошлого года, – рассказал в интервью нашему корреспонденту кандидат биологических наук, миколог Михаил Вишневский. – Другое дело, что среди них много поврежденных. Недавно знакомые принесли мне 20 килограммов подосиновиков, из которых мы отобрали всего 8 (не килограммов, а штук!) нечервивых. Из-за жары и высокой влажности молодые грибы лопаются, да еще на них набрасываются полчища насекомых – грибных вредителей».

Миколог уверен – на количество грибов второй волны (позднее лето – осень) повлияет погода второй половины июля – первой половины августа.

«Если в это время пойдут нормальные дожди, грибов будет много, – прогнозирует Михаил Вишневский. – Влага, которую почва получила с начала лета, уже испарилась. Но, в любом случае, грибов в этом сезоне вырастет больше, чем в прошлом году».

ГДЕ ИСКАТЬ?

Общеизвестно, что ни один грибник под страхом смерти не выдаст свои "злачные" места. Тем не менее некоторые пользователи соцсетей охотно делятся такой информацией, вернее, задают направление, где искать.

Судя по комментариям в группе «Грибы Ленинградской области ВКонтакте, грибов нынче много в Выборгском районе (очень хвалят места у поселка Кирилловское), в приозерских лесах.

По поводу этого направления любительница «тихой охоты» Наталья Пудовкина пишет: «Северо-Запад убил до конца своим количеством красных! Три смены обуви и одежды увенчались обалденным урожаем! Сижу, любуюсь...»

Ее коллега по увлечению из Выборга Елена Коковкина дополняет: «Огромный «улов» грибов в субботу под Выборгом. Куча слепней, сухой лес, жара, но нас это не остановило)».

Наталья Кондрашова чуть шире приоткрывает завесу тайны: «По Скандинавии поворот на Кирилловское, там проезжаете весь поселок, переезжаете железную дорогу, и прямо эта дорога до Каменки, не доезжая ее, и будет... Если от Каменки ехать по дороге на Выборг, не только грибные, но и брусничные места. Удачи!»

Анна Махлина – тоже сторонник «грибной гласности»: «Вуокса, Гремучий шлюз. Красные, подберезовики, лисички. Подберы растут семейками по 5-6 штук, хорошо, если можно взять хотя бы один. Почти все червивые. Грибы небольшие, с виду крепкие, но только тронешь – сразу рассыпаются».

По поводу других районов комментариев гораздо меньше.

А вот петербуржец Александр Елисеев не раскрывает тайну своих грибных мест, потому, видимо, его и постигло «грибное наказание»: «А мне, – пишет он, – запретили в дом грибы приносить в этом году... Сегодня последняя капля была. Корзинка и ведро. .. Домашние кричат, чтобы выкинул все, и чтоб ни рыбы, ни грибов, ни ягод больше в дом! Две морозильные камеры битком забиты и мариновано 17 банок... А сезон, можно сказать, не начинался. Все родные взбесились... Теперь если только продавать...»

КАК УЗНАТЬ?

Подосиновики, подберезовики, лисички, белые грибы, летние опята, сыроежки, маслята, шампиньоны – вот стандартная «добыча», с которой в начале июля при желании и старании можно вернуться из леса.

Рассказ о них начнем с «царя грибов» – белого, которого иногда называют боровиком. Обычно он встречается в умеренно увлажненных местах, среди хвойных деревьев, гораздо реже – на торфяниках и болотных почвах. Если в лесу есть мхи и лишайники, значит, здесь же и белый гриб. Хоть этот вид и считается светолюбивым, он прекрасно себя чувствует и в тени, под густыми кронами. Если воздух холоден, а грунт переувлажнен, «грибной царь» является людям на открытых, хорошо прогреваемых участках. Отличительная особенность этого гриба в том, что цвет мякоти не меняется на срезе и не темнеет при сушке, потому его и называют «белым».

В березовых лесах он часто соседствует с лисичкой – грибом, у которого шляпка и ножка слились воедино. Эти желто-оранжевые создания можно повстречать повсеместно в наших лесах, чаще во влажном мху и среди травы, особенно после грозового ливня. Лисички – не одиночки, они, как правило, растут целым семейством. Так что, если увидели одну лисичку – ищите и остальные, было бы место в лукошке.

Подберезовик потому так и назван, что чаще всего встречается в березовых лесах. Его излюбленные места – на опушках, в оврагах, вдоль лесополос, возле болот и, вообще, там, где сыро. У подберезовика нет привычки прятаться в траве. Интересно, что если срезать этот гриб возле шляпки, то место среза порозовеет, а срез ножки позеленеет или даже почернеет.

Еще один гриб с говорящим названием – подосиновик, его лучшие соседи – молодые осины. Но не чуждается он и берез, да и в сосновом бору тоже встречается. Его стихия – перелески, опушки, заброшенные поля. Нередко подосиновик называют красноголовиком, или красным грибом, – по окраске шляпки, которая, впрочем, может быть и бурой, и оранжевой, и даже белой. Ножка у подосиновика более толстая, чем у подберезовика, и на срезе синеет.

Летние опята растут большей частью на гнилой древесине и поврежденных деревьях, предпочитая лиственные породы, особенно березу. Его шляпка двуцветная (желтовато-бурая или ржаво-коричневая) и на вид водянистая, ее внешний край более темный.

Сыроежки, вопреки привлекательному названию, лучше не есть сырыми – можно получить серьезное отравление. Растут они в основном в лиственных лесах, реже в хвойных – как одиночно, так и группами. Цвет шляпки варьируется от ярко-красного до светло-желтого. Ножка внутри полая.

Масленок можно узнать по скользкой, маслянистой шляпке с небольшим бугорком в центре. Обычно он соседствует с молодыми соснами, но встречается и в смешанных лесах. Предпочитает открытые, светлые места, песчаную почву.

У шампиньона в молодости шляпка шарообразная, а в зрелости – зонтикообразная. Мякоть на воздухе желтеет и буреет. Этот самый распространенный в мире гриб любит влажную питательную почву, обитает на лесном и луговом перегное, его можно повстречать на коре отмерших деревьев и на муравейниках.

КАК НЕ ОТРАВИТЬСЯ?

«Тихая охота» – это всегда праздник, но, чтобы грибной пир не превратился в грибное отравление, следует соблюдать несколько простых правил.

Первое и главное – ни в коем случае не рвать незнакомые грибы! Если у вас возникло хоть малейшее сомнение, не экспериментируйте, оставьте грибочек в покое – пусть себе растет.

Так как грибы имеют свойство впитывать вредные вещества, неразумно их собирать вдоль шоссейных дорог с интенсивным движением, а лучше углубиться в лес не менее чем на 100 метров от автотрассы. Близость завода или мусорной свалки тоже должна остановить руку, готовую отправить гриб в корзину, как бы аппетитно он ни выглядел.

Грибная старость для грибника – точно не радость. Пищевое отравление могут вызвать все дряхлые, перезрелые и заплесневелые грибы (плесенью зачастую поражены опята).

Недалек путь от дегустации до реанимации, если попробовать сырой грибок на вкус. Об этом вовсе не думают те, кто советуют так делать.

Опасными могут быть и грибы-детки, ведь не каждый грибник способен отличить мелкую сыроежку от маленького мухоморчика.

Конечно, нельзя забывать и о правилах гигиены – руки мыть перед едой необходимо всегда, но особенно после прогулки в лес – до чего там только не пришлось дотрагиваться.

И вот что еще важно. Собирая грибы, не стоит полагаться только на их описания в справочной литературе. Какой-нибудь едва уловимый, но очень важный признак можно и не заметить. Лучше всего, когда рядом опытный грибник, который всегда даст полезный и своевременный совет.

Грибной сезон в наших краях только начинается, будет ли он радостным и увлекательным, не превратится ли в хождение по врачам, зависит от самих грибников.

Леноблинформ

Михаил Козлов, Леноблинформ  

где собирать грибы в Ленинградской области

Даже ограничения ввиду пандемии коронавируса не смогли сломить боевой дух любителей тихой охоты из Ленинградской области. Едва ввели послабления - как грибники 47 региона дружно направились в леса в поисках добычи.

Среди самых грибных мест Ленинградской области называют Приозерский район (рядом с Лосево, Борисово, Мичуринское, Сосново, Снегиревка), Выборгский район (Зеркальное озеро, Первомайское, Рябово, Рощино и место старого финского аэродрома у деревни Вещево), Курортные районы Санкт-Петербурга, Всеволожский район (Ладожское озеро, Новое Девяткино, ж/д станция Бернгардовка).

Вместе с тем, знатоки отмечают, что в этих местах приходится сражаться за каждый гриб с товарищами по увлечению из Петербурга и различных районов Ленинградской области. Опытные грибники давно присмотрели себе заповедные местечки, о которых опасаются рассказывать остальным (как рыбаки - о местах, где лучше всего клюет). А некоторым просто везет.

2020 год стал богатым на грибной урожай - ввиду дождей или малолюдности в период действия ограничительных мер. 

Первые грибы в году - "подморозовики", как их в шутку назвали местные жители - нашли в начале января в Лужском районе. Причина раннего слоя - аномальная зима, считают грибники. Однако после этого ждать полноценной добычи пришлось несколько месяцев - до самой весны. И первый "урожай" аккурат на 8 марта - алые пяточки саркосфицы. После - краснокнижный гриб Sarcosoma из Ломоносовского района. Ну а первый полноценный урожай случился у петербурженки Натальи Чукавовой, которая собрала корзину Саркосцифы австрийской в Пушкинском районе Ленинградской области, благодаря чему попала в СМИ - в том числе и на 47channel.

 

Петербурженка собрала в Ленобласти урожай грибов 

Недавно жительница Санкт-Петербурга похвасталась в социальных сетях, что собрала около литра грибов в Ленинградской области. Девушка рассказала об этом в группе "Грибы и Грибники СПб" во вторник, 10 марта. 

Однако полноценное начало грибного сезона объявили во второй половине июня 2020 года любители тихой охоты из группы "Грибы и Грибники СПб" во "ВКонтакте". Первые полноценные корзины собрали в Выборгском, Лужском и Всеволожском районах Ленинградской области. На тихую охоту выходили с ножами, четвероногими друьями, по пути домой и даже организовывая поход всей семьей.

По итогам начала сезона тихой охоты Ленинградская область попала в ТОП-3 регионов для тихой охоты.

 

Ленобласть попала в ТОП-3 лучших регионов для тихой охоты 

Российские грибники признали Ленинградскую область одним из лучших регионов России для тихой охоты. Об этом вчера, 1 июля, сообщил сервис бронирования жилья Tvil.ru со ссылкой на свои исследования. 

В июле 2020 рекорды по "урожаю" ставили грибники из Лужского и Всеволожского районов Ленинградской области. Добычей порой становились не только грибы, но и необычные встречи. Так, между Рапполово и автодорогой "Сортавала" во Всеволожском районе Ленобласти любительница тихой охоты повстречала "природную тварь" - обнаженного мужчину, который попросил разрешения сфотографировать ее корзины, полные добычи, после чего дал "добро" на дальнейшие сборы и ушел в кусты.

 

В Ленобласти грибник повстречал в лесу голого мужчину, который представился "природной тварью"

Во Всеволожском районе Ленинградской области любительница тихой охоты повстречала обнаженного мужчину, который представился ей "природной тварью" и попросил разрешения сфотографировать добычу - грибы - на телефон.

Во второй половине месяца Лужский район уступил по урожайности Ломоносовскому. Всеволожский район по-прежнему держался в лидерах как самое богатое на добычу место.

На момент подготовки публикации лидер по "урожайности" - Всеволожский район: больше всего сообщений за минувшие сутки о богатой добыче поступило именно оттуда. Второй по плодородности - Курортный район Петербурга. Далее идет Выборгский, Ломоносовский и Приозерский. Еще грибы можно найти в Волховском, Кировском, Лужском и Кингисеппском районах Ленобласти и Колписнком районе Санкт-Петербурга.

Поделиться статьей:

смотреть на карте, грибы июль, август, сентябрь где и какие собирать

Иногда просто тянет заняться интересным спокойным занятием – прогулкой по лесу, совмещенной со сбором грибов или «тихой охотой».

Территория Ленинградской области имеет все условия для того, чтобы принять тысячи жителей Петербурга в поисках даров природы.

Прежде чем выходить на сбор грибов, стоит подготовиться, внимательно изучив места, пригодные для подобного мероприятия и богатые урожаем.

Ленинградская область: смотреть грибные места на карте

Карты грибных мест составляются благодаря информации от грибников, которые выходят на сбор грибов не первый год. Ими указаны места, наиболее богатые грибами. Без полной корзины грибов точно не уйти со следующих мест:

  • Приозёрский  район, по направлению Выборгского шоссе – Сосновый бор;
  • Посёлки Сосново и Кирилловское;
  • Лужский район;
  • Пос. Заходское;
  • Прилегающие к озеру Зеркальному территории.

Перечень мест для сбора грибов весьма условен. Для конкретной информации и составляются многочисленные карты, одна из которых приводится ниже.

При правильном сборе грибов на одном и том же месте из года в год можно собирать богатый урожай. Для этого нужно срезать острым ножом, не вырывая с частями грибницы из земли. Это способствует их разрастанию и увеличению площади сбора.

На сегодня многие грибники собираются группами и обсуждают итоги «тихой охоты» между собой.

Социальная сеть ВКонтакте создала приложение для грибников. Каждый желающий может присоединиться к сообществу более четырёх тысяч грибников. Те, кому повезло, не только делятся фото своих трофеев, но и предоставляют информацию по местам сбора.

По последним данным июля этого года грибными местами названы следующие территории:

  • Пос. Вырица;
  • Тосненский район;
  • Пос. Новое Девяткино;
  • Гатчинский район и др.

Ознакомившись с местностью и выбрав маршрут, можно рассчитывать на полные корзины грибов. Если в планах изучение локаций в группе, то регистрация не обязательна, — грибные места доступны для изучения всем желающим.

Где собирать грибы в Кирилловском. Когда и куда пойдут грибы в Ленинградской области. Где собирать белые, осиновые и подберезовые грибы

Не теряют популярности грибы. Для многих собирание грибов - это способ провести выходные. В древности на Руси было много пословиц и поговорок, связанных с грибами:

«Кто встанет раньше, тот найдет сильных, кто спит на восходе солнца - найдет гнилые леса», «Если собираешь грибы, посмотри на дубы.Чтобы не заблудиться внезапно, знайте, где север, где юг. «Правила проверенные временем, ценители« тихой охоты »соблюдаются и сегодня.

Но главное правильно выбрать сезон. Он начинается в июле и длится до октября. Заядлые охотники бродят по лесам Ленинградской области и возвращаются с полными корзинами. Сборщики грибов считают, что добычу можно найти в любом лесу, но нужные места держатся в секрете. Попробуем раскрыть маршруты любителей «тихой охоты».

Для удобства чтения сохраните изображение на свой компьютер.

Грибные места Ленинградской области: куда пойти на выходных

Список грибных мест составлен на основе данных нескольких прошлых лет. Что касается сбора грибов, то год за годом не бывает, и портал Kolesa.Ru не может со стопроцентной точностью выяснить, как обстоят дела во всех указанных местах на данный момент... Удачной охоты!

Новое Девяткино

Кратко о месте. Лес в районе Нового Девяткино - это, пожалуй, ближайшее к городу грибное место. Знающие люди идут к нему от метро, ​​и дорога занимает у них не более 10 минут ...

Район: Всеволожский.

Удаленность от города *: около 4 км от КАД.

Как добраться: съезд с КАД на Токсовское шоссе, затем на Новое Девяткино.

Вероятность застрять в пробке на дороге: пробки в этом направлении обычно случаются по вечерам, и все мы знаем, что в это время настоящие грибники уже проводят сортировку и уборку собранного урожая в домашних условиях. Поэтому мы будем считать этот короткий путь практически бесшовным.

Бернхардовка

Кратко о месте. Еще одна возможность, проехав совсем немного от города, вернуться с хорошими «трофеями».

Район: Всеволожский.

Удаленность от города *: около 5,5 км от КАД.

Как добраться: от улицы Коммуны по Рябовскому шоссе, далее по Дороге жизни до окраины Всеволожска.

Вероятность застрять в пробке на дороге: последний раз пробка на Дороге Жизни была зафиксирована месяц назад - пробки по дороге носят эпизодический характер.

Семрино (ж / д станция "46 км")

Кратко о месте.Одно из самых «урожайных» (особенно в сезон), но в то же время - и самых известных грибных мест у дачников вдоль Витебской ветки железной дороги.

Район: Гатчинский.

Как добраться: первый вариант - по Пулковскому и Киевскому шоссе до объездной дороги вокруг Гатчины, затем небольшой участок по трассе N114, затем по трассе A120, затем по второстепенной дороге в сторону Семрино; второй вариант - через Пушкин, Павловск, Федоровское, Форносово по трассе h333, затем по трассе A120.

Вероятность застрять в пробке на дороге: при выборе первого варианта можно встать на Киевском шоссе в районе Пулковских высот за счет строительства путепровода на Волхонском шоссе; если ехать по второму маршруту, то можно застрять в Пушкине на Павловском шоссе, а пробка, скорее всего, будет тянуться до Павловска.

Пухолово

Кратко о месте. Речь идет о лесу в окрестностях Мги между деревнями Войтолово и Сологубовка.Если ехать от Пухолово до станции Турышкино и дальше - в сторону Старой Малуксы, то там много болот, поэтому в сентябре можно смело ехать туда не только за грибами, но и за клюквой.

Район: Кировский.

Удаленность от города *: около 50 км от КАД.

Как добраться: с КАД - по Мурманскому шоссе до выезда на Кировск, потом по Неве до Кировска, потом по трассе А120 до Пухолово через МГУ.

Вероятность застрять в пробке на дороге: встать можно по Мурманскому шоссе, при въезде на ремонтируемый путепровод в Разметелево.

Нурма

Кратко о месте. Известное место для грибников в Санкт-Петербурге разных видов грибов: от «соленых» (солёных) до т. Н. «Благородный» (белый, осина и др.).

Район: Тосненский.

Удаленность от города *: около 50 км от КАД.

Как добраться: с КАД - по Московскому шоссе до Тосно, далее - по городу по Московскому шоссе и проспекту Ленина, с которого нужно повернуть налево на Баберинское шоссе; далее - по трассе Р40 до Нурмы.

Вероятность застрять в пробке на дороге: на Московском шоссе практически в любой день недели «встать» можно в районе Ленсоветовского, в Московской Славянке, перед поворотами. Пушкину и Колпино.

Синявино

Кратко о месте. Не очень далекое, но хорошее (по результатам) место. Главный минус - большое количество грибников, особенно в сезон, так как Синявино - одна из крупнейших садоводческих площадок в регионе.

Район: Кировский.

Расстояние от города *: около 60 км.

Как добраться: с объезда - по Мурманскому шоссе до пос. Синявино.

Вероятность застревания на дороге: очень высокая.Застрять (пусть и не «тупо» и ненадолго) можно, в первую очередь, в районе села Разметелево из-за ремонта путепровода, а также перед поселком самого Синявино - там, где Мурманское шоссе сужается с четырехполосной трассы до обычной загородной трассы, по одной полосе в каждую сторону.

Сосново

Кратко о месте. Одно из самых известных грибных мест Приозерского района, до которого сравнительно легко добраться.Лесной массив очень большой и богат различными видами грибов. Правда, последствия прошлогоднего урагана несколько затрудняют подход к грибным участкам - здесь много поваленных деревьев.

Район: Приозерский.

Удаленность от города *: около 60 км от КАД.

Как добраться: с КАД - около Выборгского шоссе до поста ГАИ, далее по Приозерскому шоссе.

Вероятность застрять в пробке на дороге: встать можно уже на съезде с КАД: светофор на посту ГИБДД, как правило, собирает длинные «хвосты» во все стороны.

Зеркало озера

Кратко о месте. Одно из самых грибных мест не только Выборгского района, но и всей Ленинградской области.

Район: Выборгский.

Как добраться: с КАД - по Приморскому шоссе через Сестрорецк, Зеленогорск, Песочное до Зеленой Рощи, далее по второстепенным дорогам через ж / д. Изобразительное искусство. Яппиля к озеру.

Вероятность застрять в пробке на дороге: от Сестрорецка до Зеленогорска можно ехать по «верхней» или «нижней» трассе, самая быстрая - первая.На обратном пути часто возникают пробки на стыке обеих магистралей с Приморским шоссе.

Лаврово / Кобона

Кратко о месте. Очень большой лесной массив, и поблизости нет больших садов. К тому же эти места исторические: именно через Лаврово и Кобону по Дороге Жизни везли хлеб и продукты в блокадный Ленинград.

Район: Кировский.

Удаленность от города *: около 70 км от КАД.

Как добраться: с КАД - по Мурманскому шоссе до села Дусево, далее - 10 км второстепенными дорогами до Лаврово.

Новая деревня / Кипуя

Кратко о месте. Огромный лес, протянувшийся практически от Мурманского шоссе до Ладожского озера. Есть много болот. В прошлом году эти районы пронесся ураганом, но лес был поврежден лишь частично.

Район: Волховский.

Удаленность от города *: около 80 км от КАД.

Как добраться: с КАД - по Мурманскому шоссе до указателя «Кипуя», далее - по второстепенным дорогам.

Вероятность застревания на дороге: очень высокая. Самые «пробки» - перед эстакадой в Разметелево, напротив Синявино. Интенсивное движение - перед мостом через реку Сарья в Душево.

Сезон грибов в лесах под Санкт-Петербургом считается с августа по ноябрь, а вот съедобные грибы в Ленинградской области можно встретить практически круглый год... Сосредоточьтесь на календаре грибника ниже - он охватывает самые популярные из более чем 200 видов съедобных грибов, произрастающих в лесах Ленинградской области.

Грибной календарь по Ленинградской области
Месяц сбора Виды грибов Особенности коллекции
Январь Вешенка Грибникам в пустой месяц в лесу искать практически нечего.Но если зима теплая, можно найти свежие вешенки. Обычно они растут на деревьях, шляпка у такого гриба односторонняя или округлая, пластинки спускаются к ножке, как бы подрастая к ней. несъедобные грибы это несложно - шляпка у них совершенно без кожицы на ощупь.
Февраль Вешенка, древесные грибы Если нет оттепели, то в лесу искать практически нечего
Март Вешенка, древесные грибы, болтушка Грибов практически нет, но в конце месяца могут появиться первые подснежники.
Апрель Вешенка, опята древесные, болтушка, сморчок, шитье Подснежники довольно распространены - сморчки и строчки
Май Сморчок, вышивка, масленка, вешенка, плащ Большинство грибов можно найти не под деревьями, а на полянах, в густой траве.
июнь Масленка, подберезовики, подберезовики, вешенка, сморчок, опята, лисички, белые грибы, плащ В июне начинают появляться грибы высшей (первой) категории.
июль Масленка, подберезовики, подберезовики, вешенка, сморчок, плащ, опята, лисички, белые грибы, маховик Грибов уже много - и на полянах, и под деревьями. Помимо грибов уже встречается клубника и черника.
Август Масленка, подберезовики, подберезовики, вешенка, сморчок, опята, лисички, белые грибы, маховик В настоящее время грибы можно встретить практически повсюду: в траве, под деревьями, возле пней, в канавах и на деревьях, и даже на городских площадях и обочинах дорог.Помимо грибов уже созрела брусника, а на болотах появилась клюква.
сентябрь Масленка, подберезовики, подберезовики, вешенка, сморчок, опята, лисички, белые грибы, маховик. Сентябрь - самый урожайный месяц для грибов. Но нужно быть осторожным: в леса приходит осень, и в яркой листве сложно разглядеть разноцветные шляпки грибов.
Октябрь Валуй, вешенка, гриб, опята, шампиньоны, подберезовики, белые грибы, молочный гриб, мухомор, сыроежка Количество грибов на полянах начинает уменьшаться.В октябре грибы лучше искать возле пней и под деревьями.
Ноябрь Масленка, зеленый чай, вешенки, лесные грибы. Начинается замораживание, и велика вероятность найти замороженные грибы.
декабрь Вешенка, древесные грибы Грибов уже почти нет - но если повезет, можно найти остатки осеннего изобилия

Информация о том, куда пойти за грибами в августе 2018 года в Ленинградской области.

Вы знаете, чем пахнет лес? Пахнет воздухом! Те, которых вы не встретите в городе днем ​​с огнем. Еще он пахнет грибами. В сезоне. Которая сейчас, по сути, вовсю набирает обороты. К сожалению, у нас нет ежедневной возможности ехать за грибами, хотя мы знаем куда (я имею в виду не только Ленинградскую область, но и Карелию, и Псковскую область, и даже). С детства помню, как рано утром (точнее, поздно вечером) в полусне меня посадили в машину, загрузили корзины с едой в багажник и уехали куда-то далеко.Весь день. Так что я знаю все места, куда пойти за грибами в Ленинградской области в конце лета и осенью. И без сожаления эти места сейчас горят.

(Фото грибов украли из интернета, потому что мы собираем грибы, а фотографировать забываем))))). Если собственник найден, укажите ФИО)


Грибные места Кировской области

Отрадно. Подберезовики только что попали туда. К следующим выходным они наконец выйдут.Информация проверена друзьями-приятелями.

Войтолово и Сологубовка (около 50 км от кольцевой развязки). Это больше, чем большой лес. Еще он хорош тем, что здесь есть болота, на которых осенью растет клюква.

Синявино. Хорошее грибное место в Ленинградской области, но слишком популярное. Сюда ездят на электричках и на машинах. И местных дачников хватает. Итак, если вы думаете, куда пойти за грибами и решили поехать в этот уголок Ленинградской области, вставайте пораньше.

По мнению наших друзей, лучшее грибное место в Кировском районе Ленинградской области - Лаврово. Чуть дальше Синявино, но садоводства нет и, как следствие, некоторые грибники сметены.

Грибные места в Приозерском районе

Самое первое, что приходит на ум, когда думаешь о грибных местах в Приозерском районе, - это Сосново. Это грибное место приходит на ум не только нам, но и всем, кто отправляется на грибную охоту в Ленинградской области.Здесь много грибов, но очень немногим из них удается вырасти. Отрезан, пока все еще находится в зачаточном состоянии.

Грибные места Выборгского района

АХТУНГ! Август 2018 - белые и подберезовики в большом количестве в Каменке на полигоне! Мы все идем туда! Ну, лисички там тоже понаехали.

Выборгский район богат грибами. У Кеши там дачка в огороде в лесу, и иногда стоит выйти за ворота, так как можно встретить несколько «благородных».Поэтому вопроса «куда поехать собирать грибы в Ленинградской области» часто вообще нет - мы просто едем на дачу. А наша дача находится в Яппиля.

В 5 км от Япполя находится еще одно известное грибное место в Выборгском районе - озеро Зеркало. Это точно, если вы решите, куда пойти за грибами в Ленинградской области, чтобы вернуться с полной корзиной - «Зеркальное» будет беспроигрышным вариантом.

Танковый полигон Каменка. Грибов много, но стреляют.Хотя о стрельбе предупреждают заранее.

Первомай. ... Наше любимое грибное место в Ленинградской области. Позавчера мы собрали целое ведро грибов и подберезовиков, идя медленно и с ребенком. Сам ребенок нашел белых людей и был безумно счастлив. И черники и брусники удивительно много.

Грибные места Всеволожского района

Агалатово. Правда, там, по отзывам, в этом сезоне грибников больше, чем грибов.В том смысле, что грибов много, а тех, кто нашел неправильный ответ на вопрос «куда пойти собирать грибы в Ленинградской области», еще больше. Так что сто раз подумайте. Ехать недалеко, но стоит ли постоянно здороваться с соперниками?

ИН Бернхардовка тоже есть чем поживиться. И, что удивительно, здесь людей меньше, чем в Агалатово.

Пери и Милл Крик. Тоже неплохо и близко.

стр.С. И выезжайте пораньше, чтобы не застрять в пробке. Желающих съездить в грибные места Ленинградской области очень много!

Поиск рейса:

Лучшие предложения от авиакомпаний - >>

Поиск отелей по всему миру:

Выберите отель сейчас и сэкономьте ->

Планируйте наперед: Не забывайте о страховке:

Принято считать, что для сбора грибов используется идеальное время летом и осенью.Это оправдано появлением в этом сезоне большого грибного изобилия. Более опытные грибники уже заранее обозначили, так сказать, плодородные места в лесах.

Какие грибы распространены в лесах Ленинградской области

Они образуют следующий список:

Где много грибов в Ленинградской области

Очень значительное их количество наблюдается в поселке Сосново, расположенном в г. центральная часть леса, в которой преобладают хвойные деревья.Здесь можно встретить разные виды грибов, но самые распространенные, такие как красные и желтые сыроежки, черные молочные грибы, биттеры и лисички. Подберезовики и белые грибы в Ленинградской области тоже можно встретить в дождливый сезон. Добраться до этого поселка можно из Санкт-Петербурга поездом, который отправляется с Финского вокзала.

Также у заядлых грибников популярно такое место, как железнодорожная станция Бернгардовка, а точнее окрестные леса.

Если вы хотите узнать, где в Ленинградской области много грибов, то вам стоит обратить внимание на такой поселок в хвойных лесах, как Снегиревка. Много лисичек, грибов, руссул, подгрузок, реже осины с белыми грибами. Чтобы добраться до него, сначала нужно сесть на электричку до уже упомянутого села Сосново, а затем на автобусе - до нужного места.

Недалеко есть еще одна грибная деревня - Лосево.Также есть электричка от финского вокзала. Здесь растут грибы, подберезовики, а если год урожайный, то лисички.

Белые грибы в Ленинградской области (поселок Стекольный) встречаются в изобилии почти каждый год соответствующего сезона. Однако главная сложность - как добраться. Добраться до этих мест можно только на машине.

Что нужно знать о грибах

  • Первое, что следует помнить тем, кто намерен заниматься плодотворной «тихой охотой» - грибы часто растут группами, поэтому стоит присмотреться к уже найденным образец.
  • Второй момент - не стоит собирать подозрительные, тухлые или незнакомые грибы.
  • И в-третьих, их следует класть в корзину или корзину, поскольку они лучше всего способны обеспечить циркуляцию воздуха, необходимую для сохранения грибов.

Когда лучше идти в лес

Сезон грибов в Ленинградской области приходится на период с начала лета до середины осени. В сентябре летний урожай сменили осенние грибы... Теперь в лесу их ценителям будут доступны луга опят, свиней, волушек, беляков, подберезовиков, подгрузок и др.

Извините, октябрь - последний месяц грибного сезона, а вот опята поздние, последние волны, белки и грибы по-прежнему могут радовать всех своих поклонников.

К чему может привести сбор грибов неподготовленным любителям в Ленинградской области?

По имеющимся официальным данным, 10 сентября 2014 года в реанимационном отделении токсикологического отделения НИИ им.В. Джанелидзе оказались тремя петербуржцами, отравленными ядовитыми грибами, собранными во Всеволожском и Тосненском районах Ленинградской области.

По словам начальника вышеуказанного отдела Олега Кузнецова, точно определить вид гриба, вызвавшего отравление, очень сложно. Предположительно, это мог быть (самый ядовитый гриб).

С начала сезона «тихой охоты» в Санкт-Петербурге это шестой случай отравления.В августе были зарегистрированы первые жертвы - одна женщина и двое мужчин. По словам того же руководителя, на сегодняшний день двое пациентов переведены из реанимации, а состояние одного пострадавшего все еще тяжелое.

Таким образом, следует учитывать, что в Ленинградской области «грибы» не только съедобны, но и ядовиты. Необходимо внимательно подойти к вопросу выбора съедобного экземпляра.

Какие грибы родились в начале этого сезона в Ленинградской области

Первыми грибами стали летние представители, пришедшие на смену майским линиям и сморчкам.Их можно было найти на бревнах, гнилых и лиственных пнях. Грибы Ленинградской области в июне по количественной составляющей в основном были представлены грибами.

Также в первый месяц лета можно встретить так называемые колосковые грибы. Это название не научное, а народное. Давно замечено, что самые популярные грибы начинают появляться еще до сенокошения и колошения ржи. Отсюда и их название - сенокосы или колоски.

Их официальное название - подберезовики, подберезовики, белые грибы и «грибной король» - подберезовики.Выполняют, без преувеличения, главную цель настоящих грибников. В связи с этим существует поверье: пока не будет найден первый белый гриб, сезон не считается открытым.

Что такое белые грибы и где они водятся?

Такое название они получили из-за того, что трубчатый слой нижней поверхности их шляпки, преимущественно у молодых представителей, остается белым даже после высыхания, в отличие от других грибов этого семейства, у которых он становится черным.

Одним из показателей их ценности является стойкость аромата, который сохраняется при любой обработке и в любом блюде.По вкусовым и питательным свойствам, содержанию витаминов именно белые грибы занимают лидирующие позиции среди всех своих собратьев. Он относится к 1 категории и употребляется в пищу как в свежем, так и в сушеном, соленом и маринованном виде.

Содержит ингибирующие антибиотики. Также есть официальные данные о том, что белые грибы также содержат вещества, которые могут бороться с рядом опухолей.

Чаще всего они сосредоточены в сосновом лесу. Основываясь на многолетнем опыте знающих грибников, их сезон начинается в последней декаде августа и длится примерно 10 дней.По истечении этого срока белые грибы еще можно будет найти, но только в небольшом количестве, около десяти штук.

Белые грибы в Ленинградской области в основном обитают в таких местах, как Кирилловское, Яппиля, Местерьярви, Заходское, Гаврилово, Тарасовское, Алеховщина и на полигоне под Лугой.

Отличительные особенности бледной поганки

Неопытные грибники часто принимают ее за шампиньон или зеленую сыроежку ... Поэтому стоит выделить три основных различия между ними:

  1. Поганка всегда имеет утолщение в нижней части. часть ножки, а у вышеперечисленных грибов нет.
  2. Ее пластины на шляпке с внутренней стороны абсолютно белые, а у шампиньонов - розовые.
  3. Ножка поганки имеет тонкое кольцо, расположенное чуть ниже шляпки.

Стоит усвоить правило: «Мы собираем грибы в Ленинградской области и всегда помним эти вышеупомянутые отличия, а в случае сомнений лучше не брать этот экземпляр!»

Где искать подберезовики в Ленинградской области

По словам опытных грибников, они любят такие места, как болота, а также места, где растет большое количество берез.Даже если посередине у них вырастут подберезовики. Эти грибы появляются в самом начале лета и имеются в большом количестве до конца сезона.

Если возникает вопрос, где много грибов в Ленинградской области, в частности подберезовики, то смело озвучивайте такие места, как Кирилловское, дорога на Каменку и прилегающие территории села Ягодное. Более того, грибы в этих местах прошли лабораторные исследования, по результатам которых было выявлено в десятки раз меньше вредных веществ, чем установлено нормой.

Богата ли Ленинградская область боровиками?

Среди трубчатой ​​разновидности после ранее считавшейся белой занимает почетное второе место по критерию пищевой ценности (вторая категория). Его употребляют как в вареном, так и в жареном, маринованном и сушеном виде. Он признан самым быстрорастущим грибком.

Эти грибы в Ленинградской области распространены так же, как подберезовики. Это наиболее часто встречающиеся и узнаваемые съедобные грибы.Главное их преимущество в том, что осиновые грибы нельзя спутать ни с какими другими грибами, в том числе и ядовитыми. Тем не менее, дряблые экземпляры лучше не собирать, так как они будут гнить, еще находясь в корзине.

По многолетним данным опытных грибников, в Ленинградской области можно выделить места, где много грибов, а именно осины. К ним относятся: Мшинская, Каннелярви, Сосново, Кузнечное, Вырица, Рощино, Горьковское, Приозерск и Лосево.


Фото: visitkamchatka.ru

Темы дня

    У каждого грибника, как правило, есть свое особое место, куда он отправляется собирать лесные деликатесы. «Санкт-Петербург.ру» рассекретили грибные места в Ленинградской области.

    Начался спокойный охотничий сезон. У каждого грибника, как правило, есть свое особое место, куда он из года в год отправляется собирать лесные деликатесы. И такие места всегда хранятся в строжайшем секрете.Однако все секреты рано или поздно выясняются. Руководствуясь этим правилом, «Санкт-Петербург.ру» рассекречивает грибные участки в Ленинградской области.

    Saint-Petersburg.ru обновил информацию о местах сбора грибов в Ленинградской области - актуальная информация за 2016 год по ССЫЛКЕ

    Где найти грибы:

    Село Сосново славится тем, что местные жители успевают собирать грибы, гулять с собакой или выбрасывать мусор.В общем, это неудивительно, ведь деревня находится почти посреди леса. Сосновские леса относительно сухие, смешанные, с преобладанием ели и, конечно же, сосны. Практически повсюду в окрестностях Сосново собирают самые разные грибы - очень большая территория Сосновского сельского поселения. Охотники за осенними деликатесами отмечают обилие черных грибов, часто встречаются красные и желтые сыроежки, лисички и биттеры. В сезон и хороший год собирают как белые, так и осиновые грибы.Добраться до Сосново можно поездом с Финляндского вокзала.

    По словам грибников, полную корзину грибов можно забрать в районе ж / д станции Бернхардовка. Правда, от вокзала до леса идти около получаса. Также до Бернгардовки можно добраться поездом, отправляющимся с Финляндского вокзала.

    Леса села Снегиревка (близ Сосново) - смешанные с преобладанием хвойных пород - удивят разнообразием грибов любого грибника. Здесь растет почти все - лисички, подгрузки, мухи и сыроежки повсеместно распространенные.Также здесь вполне можно собрать подберезовики и осины. Удобно добираться поездом до Сосново, а потом рейсовым автобусом.

    Еще одна деревня известна своими грибными залежами. В лесу у села Лосево, что рядом с рекой Вуокса, можно встретить белые и осиновые грибы, подберезовики, масленки и грибы, а также в сезон собирать лисички. Однако здесь вам придется соревноваться в скорости поиска грибов с другими многочисленными «охотниками».Добраться до Лосево можно на машине или поездом от Финляндского вокзала до станции Лосево или автобусом из Сосново.

    Некоторые грибники советуют собирать осенние дары леса только под поселком Стекольный. Говорят, что в сезон там можно собрать много белых грибов. Однако добраться до этого места можно только на машине.

    Леса между селами Борисово и Мичуринское Приозерского района характеризуются примерно одним «продуктом».Здесь много черных грибов и лисичек. Реже встречаются благородные белые, подберезовики и подберезовики. Помимо грибов здесь собирают чернику, водят бруснику и клюкву. Добраться можно автобусом из Сосново.

    На Карельском перешейке благородные грибы, по мнению опытных коллекционеров, встречаются на каждом шагу.

    Леса восточнее станции Мыллюпелто (территория, ограниченная селами Солнечное, Моторное и Починок, в 10-15 км к юго-востоку от Приозерска) также славятся разнообразием грибов.Это, по мнению грибников, одно из самых плодородных мест. Добраться сюда сложно, поэтому лучше ехать на машине.

    На островах в районе села Кузнечное чаще всего встречаются лисички. Хотя добраться туда, конечно, непросто, здесь нужна машина и водный транспорт.

    Но проще всего добраться до леса у поселка Новое Девяткино 10-15 минут пешком от метро Девяткино. Правда, в лесу здесь очень влажно.С августа по октябрь, в сезон, у Нового Девяткино даже можно найти белые грибы.

    Лес под Выборгом напротив, очень засушливый. Поэтому в августе - октябре здесь начинается настоящий сбор подберезовиков, подберезовиков и белых грибов. Добраться можно на машине или электричке с Финляндского вокзала, либо на автобусе от метро «Гражданский проспект».

    И последнее известное нам грибное место - лес около села Синявино Кировского района ... Здесь можно найти любые грибы - от сливочного масла и сыроежки до белых грибов. В этом лесу есть одно «но»: в годы Великой Отечественной войны здесь шли ожесточенные бои, поэтому образовались кратеры, в которые можно легко провалиться. Добраться можно без машины, на автобусе от метро Улица Дыбенко.

    На заметку:
    - Большинство людей думают, что грибы нужно искать подальше. Отчасти это правда. Однако чаще всего в тех местах, куда никто не смотрит, растут грибы.

    Грибы никогда не растут по одному. Если вы что-то заметили, обязательно остановитесь прямо здесь и посмотрите себе под ноги. Там должно быть кто-то прячется.

    Если вы не знаете, что за гриб, не берите. При малейших подозрениях гриб лучше просто оставить в лесу. Помните, жизнь дороже.

    Грибы лучше всего собирать в корзины из ивовых прутьев или в корзины из бересты. В целлофановых пакетах и ​​ведрах они быстро портятся из-за отсутствия воздухообмена.

    Ни в коем случае не берите уже тухлые грибы. Даже если удалить гнилую часть, вкус и здоровье гриба могут пострадать.

    Перезрелые и мягкие грибы, а также червивые тоже брать не стоит.

    Mushroom Legends:

    Говорят, что грибы не зря живут в лесу. Их комары разводят. Чтобы люди сами приходили в свои дома.

    Считается, что лягушки могут размножаться до грибов. Особенно самые маленькие.Следуйте за лягушкой, и рано или поздно вы дойдете до подберезовика или другого гриба.

    Какие грибы растут в лесах Ленинградской области:

    Масленка. Свое название он получил из-за маслянистой скользкой шапочки. Характерные черты, которые отличают большинство видов масла от других грибов этого вида, - это липкая слизистая оболочка, легко снимаемая кожица колпачка и кольцо.
    # imglib # 7136 # c

    Подберезовики. Часто растет по краям лесных дорог ... Шляпка до 15 см в диаметре, полусферическая, позже подушковидная, голая или мелкозернистая, сухая, в сырую погоду слегка слизистая.Цвет гриба может варьироваться от светло-серого до темно-коричневого.
    # imglib # 7132 # c

    Подберезовики. Часто встречается со второй половины июня по октябрь. Растет большими колониями. Шляпка гриба до 25 см в диаметре, сначала шляпкообразная с прижатыми к стеблю краями, позже подушковидно-выпуклая. Цвет шляпки гриба также может быть ярко-красным, оранжевым, серым, белым. Мякоть белая, плотная, густая, краснеющая, зеленеющая и окончательно почернеющая на срезе.
    # imglib # 7134 # c

    Опята.Растет большими группами с конца августа до поздней осени на пнях, корнях, мертвых и живых стволах лиственных, преимущественно березы, реже хвойных, иногда в зарослях крапивы. Шляпки до 13 см в диаметре, у молодых грибов шаровидные, с загнутым внутрь краем, затем плоско-выпуклые с бугорком в центре. Цвет шляпки серо-желтый, желто-коричневый с оттенками, более темный в центре, с тонкими мелкими, иногда отсутствующими коричневыми чешуйками.
    # imglib # 7135 # c

    Белые грибы.Считается королем грибов не только своими внушительными размерами, но также вкусовыми качествами и питательной ценностью. Другое название белых грибов - подберезовики, реже - божья коровка. Белый гриб может достигать огромных размеров - шляпки до 50 см в диаметре и ножки до 25 см в высоту.
    # imglib # 7138 # c

    Моховое колесо. Он принадлежит к роду трубчатых грибов и растет с начала лета до осени в хвойных, лиственных и смешанных лесах поодиночке или небольшими группами. Шляпка полусферическая, со временем становится выпуклой, а затем плоской.Сверху он бархатистый, темно-зеленый или буро-коричневый, губчатый слой ярко-желтый.
    # imglib # 7137 # c

    Все заголовки новостей

Кира Столетова

Грибные поляны возле автомагистралей и заводских мусорных баков не подходят для сбора грибов. Грибы Ленинградской области в большом количестве появляются в лесах, расположенных под Санкт-Петербургом.

Грибные места

Грибы в Ленинградской области сейчас опасно собирать из-за большого количества дорог и множества заводов, сбрасывающих отходы в реки.Под воздействием токсинов в грибах накапливаются галлюциногенные вещества, плохо влияющие на нервную систему, поэтому места сбора выбираются с особой тщательностью.

Координаты грибных мест:

  1. Сосновый завод - Приозерский район по Выборгскому шоссе.
  2. Сосновый массив - село Сосново. Электропоезд из Санкт-Петербурга курсирует от Финского вокзала до поселка.
  3. В Скандинавии, повернув к деревне Кирилловское, вы найдете прекрасные лесные массивы, поросшие грибами.Поезд идет туда.
  4. Проехав Всеволожский район, вы попадете в Сосновый Бор. Расстояние между населенными пунктами - 118 км. Более точное местоположение поможет определить атлас с названиями деревень.
  5. На юге Лужского района находится лес. Его легко найти на карте.
  6. Электропоезд курсирует до поселка Заходское. Это место идеально подходит для сбора съедобных грибов.

Грибные места Ленинградской области представлены сосновыми и смешанными лесами... Почва торфяно-песчаная. Многие грибы появляются в Ленинградской области осенью, в сентябре, весной и летом их меньше. Самые чистые находятся у озера Зеркальное сосновые боры ... Более подробное описание Координаты грибных мест Ленинградской области можно узнать, посетив клуб грибников Санкт-Петербурга.

Если в Ленинградской области начали расти грибы, нужно быть особенно осторожным, чтобы не принять ядовитые аналоги за съедобных представителей.

Описание грибов области

Грибники Ленинградской области собирают следующие виды съедобных грибов: Морель, Белые, Трюфели, Вешенки, Веселка, Лисички, Маслята, Осины, Опята.

Несъедобные галлюциногенные виды: разновидности псилоцибина, поганки, ложные грибы, мухомор, шампиньоны пожелтения, линии.

Морель

Первые яровые съедобные грибы - Сморчки. Поселяются в лесу смешанного типа в апреле-мае.Шляпка у гриба коническая, морщинистая.

Длина штанин до 10 см. Белый цвет. По вкусовым качествам он уступает только белым и осиновым грибам. Из гриба готовят разные кулинарные изыски.

Белые грибы

Белые грибы в Ленинградской области собирают с июля по сентябрь. Они растут в сосновом бору, на песчаниках. Форма шапки - круглая. Цвет серый, ножка плотная, толстая.

Съедобность гриба можно определить по приятному аромату.Ложные белые грибы или поганки имеют кисло-серный запах. Белые грибы подходят для приготовления любых кулинарных блюд, засолки, маринования, но особенно хороши они в сушеном виде.

Трюфели

Ленинградская область - один из немногих регионов, где белый трюфель ... Чтобы его собрать, нужна свинья или собака.

Коллекционирование трюфелей затруднено их подземным происхождением. Они растут на глубине до 15 см, поэтому их сложно найти. Всегда помните место, где были выкопаны трюфели, в следующем году они снова там вырастут.Места распространения этого вида держатся в секрете, так как мешок с подземными грибами может приносить доход, равный среднемесячной зарплате.

По внешнему виду трюфель напоминает сморщенное яблоко или белую айву ... Шарик имеет плотную структуру.

Вешенки

Сезон сбора вешенок начинается в сентябре и длится до самых заморозков. Съедобные грибы хвалят за низкую калорийность. Шляпка загнута по краям, по форме напоминает раковину, диаметр взрослого экземпляра достигает 25 см.Цвет от молочного до пурпурного. Ножка тонкая, высотой 2-3 см.

Мякоть сочная, плотной структуры. Растет на мертвых деревьях и пнях. Подходит для приготовления закусок, первых блюд и гарниров.

Веселка

Растет одиночно в смешанных и хвойных лесах. Пик плодовитости приходится на август. Мицелий на одном месте не образуется несколько лет.

Используется для изготовления лекарств от самых разных болезней ... Узнай по гнилостному запаху.Колпачок и ножка покрыты слизью. Самым ценным считается гриб, наполненный изнутри желеобразной жидкостью.

Лисички

Деликатесные съедобные грибы. Поверхность кепки выпуклая, по краям волны, завернутой в сторону ноги. Чем старше экземпляр, тем больше форма шляпки начинает напоминать воронку. Мякоть уплотненная, не рассыпчатая. Обладает приятным ароматом и высокими вкусовыми качествами.

Любят сосновые леса. Мицелий образуется в начале лета и растет до середины октября.Ищите их на открытых местах, под травой и листьями. Используется для приготовления солений, различных кулинарных блюд. Главное преимущество, которое ценят в лисичках грибники, в том, что они не становятся червивыми.

Масло

Грибы распространены в смешанных и хвойных лесах. Если вы его нашли, значит, где-то рядом находится целая группа ... Шляпка гриба полуконической формы, около 15 см в диаметре. Покрыта жирной коричневой кожей.

Ножка плотная, около 8 см.Он окрашен в белый цвет. Мякоть плотная, губчатая. Имеет приятный аромат хвои. Используйте продукт для жарки, варки, соления и сушки. Сезон плодоношения начинается в мае-июне и заканчивается в сентябре-октябре.

Подберезовик

Название говорит о среде обитания гриба. Шляпа полусферическая, яркая оранжево-коричневая. У взрослых особей диаметр шляпки достигает 30 см. В Сосново можно собрать 10-20 кг подберезовиков.

Нога плотная, большая, покрыта мелкой коричневой чешуей.Пульпа волокнистая. Относится к универсальным продуктам в плане использования. В жареном виде имеет вкус мяса.

Опята

Обладают приятным вкусом и ароматом. Поселяются на пнях. Шляпка выпуклая; с возрастом край становится волнистым. Средний размер 12 см.

Стебель имеет волокнистую структуру. Тонкие, длинные - 10 см, расширенные в верхней части. Мякоть белая, волокнистая. Осенние подберезовики активно плодоносят в течение всего сентября.

Цвет шляпки зависит от породы дерева, на которой поселился гриб.Медово-желтые тона придают акация или тополь. Дуб красный, а сухостой коричнево-красный.

Ядовитые грибы

Psilocybe насчитывает около 150 видов. Ядовитые грибы с галлюциногенным действием. При первом использовании очевидных последствий нет. Длительное систематическое употребление этих грибов вызывает стойкие психические расстройства.

Они растут на пнях и рядом с ними. Шапка коническая, ножка тонкая. Окрашены в серый цвет ... Сначала появляются поганки.Если хотите собрать много грибов, ориентируйтесь на их расположение, они обязательно вырастут рядом съедобных видов ... Шляпка у поганки конусовидная, розовая.

Amanita muscaria обитает в лесах любого типа, ядовита. Их ни с чем не спутать. На красных головках хорошо видны белые точки. Нога высокая белая. Место поселения ядовитых грибов похоже на съедобных собратьев. Ноги тонкие, полые, шляпки яркого цвета ... Кожура гладкая.

Пожелтевшие шампиньоны - ядовитые грибы... Колпачок белый, при надавливании становится ярко-желтым. Употребление этого сорта приводит к серьезным отравлениям. При головокружении, рвоте, потере сознания немедленно обратиться к врачу.

Линии - ядовитые сморчки-близнецы. Их шляпка бесформенная, морщинистая, плотно прилегает к стеблю по всей длине. Мякоть легкая, хрупкая, без ярко выраженного запаха. Параллельно со сморчками начинается сезон усиленного плодоношения.

сентябрь 2017 года, а грибы только в Ленинградской области - только что поехали...

Грибники (Грибы Ленинградской области 2017, Приозерский район) 1 серия

Грибы в Северной Карелии. тихая охота

Заключение

Сбор грибов в Ленинградской области начинается весной. Для удачного похода за грибами приобретите справочник с названиями съедобных и несъедобных видов, а также учтите все советы, написанные выше.

Начальная локальная адаптация гриба: эволюция толерантности к тяжелым металлам через вариации аллелей и числа копий

Abstract

Окружающая среда, измененная человеком, может определять эволюцию организмов.Грибы не исключение, хотя мало что известно о том, как они противостоят антропогенному загрязнению. Здесь мы документируем зарождающуюся полигенную местную адаптацию микоризного гриба Suillus luteus , вызванную недавним загрязнением почвы тяжелыми металлами. Сканирование генома людей из недавно загрязненных и близлежащих незагрязненных почв в Бельгии не выявило никаких доказательств структуры популяции, но обнаружило аллельную дивергенцию и вариацию числа копий генов в генах, участвующих в исключении, хранении, иммобилизации и детоксикации активных форм кислорода.Постоянная генетическая изменчивость включала несколько аллелей с небольшими эффектами, способствующими толерантности к тяжелым металлам, что свидетельствует о существовании различных стратегий противодействия заражению. Эти варианты были общими для всей популяции, но при отборе изолятов, подвергшихся загрязнению. В совокупности наши результаты указывают на то, что S. luteus проходят начальные этапы адаптивной дивергенции, и способствуют пониманию процессов, лежащих в основе местной адаптации в условиях сильного экологического отбора.

Введение

Понимание того, как окружающая среда влияет на эволюционные изменения, является давней темой в биологии 1–5 . Изменения окружающей среды особенно хорошо известны тем, что влияют на эволюцию организмов и приводят к местной адаптации, при этом люди демонстрируют более высокую приспособленность в своей первоначальной среде 6 . Новые условия окружающей среды могут предложить сильный отбор, действующий на фенотипы и соответствующие генотипы 7 . Такой отбор может привести к эволюции местной адаптации с конкретными генотипами и фенотипами, позволяющими адаптироваться в новой среде.Полная документация процессов и механизмов локальной адаптации была сложной задачей, но растущая способность обнаруживать и тестировать участки генома при отборе в широком диапазоне систем позволила беспрецедентные достижения в этой области 8,9,10,11 .

Локальная адаптация накладывает отпечатки на геномные сигнатуры, которые легче всего обнаружить, когда отбор сильный, и воздействует на несколько участков генома с большими эффектами. В этом сценарии небольшое количество генетических вариантов резко увеличивает приспособленность к определенным условиям и быстро распространяется по популяции.Такой процесс создает отчетливый генетический сигнал, при этом несколько геномных мишеней отбора сильно дифференцированы и отклоняются от оставшегося генома 12,13 . Примеры этого явления включают развитие устойчивости к пестицидам, такой как у насекомых Anopheles 14,15 и Drosophila 16 , и устойчивость к фунгицидам у грибкового патогена Zymoseptoria 17 . Однако отбор, связанный с изменениями окружающей среды, вместо этого может нацеливаться на сложные признаки, которые включают множество генов и генетических путей 18,19 .Такая полигенная адаптация была описана у кораллов на столешнице 10 , кукурузы 9 и гриба Neurospora 20 , эволюционирующих в термостойкость в меняющихся климатических условиях. Обнаружение сложной адаптации по признаку является сложной задачей, поскольку она приводит к низкой дифференциации по многим сайтам, которые трудно отличить от фонового геномного сигнала. Способность обнаруживать полигенный отбор снижается с увеличением количества аллелей, вносящих вклад в признак, поскольку множество аллелей при отборе приводит как к ослаблению сигнала отбора 21 , так и к очень низкой дивергенции по геному 18 .Кроме того, предполагается, что аллели с небольшими эффектами будут демонстрировать генетическую избыточность и постоянную вариацию 18 . Это означает, что множественные локусы независимо друг от друга придают адаптивные фенотипы, а также присутствуют с низкой частотой в популяциях, не подвергающихся отбору. Еще одно важное ожидание от аллелей с малым эффектом - их восприимчивость к потоку генов между локально адаптированными и близлежащими неадаптированными популяциями, что может привести к потере адаптивных аллелей, если отбор недостаточно сильный 22–24 .Здесь мы исследуем геномные признаки адаптации к тяжелым металлам у Suillus luteus , мутуалистического гриба сосны. Наша цель состояла в том, чтобы определить, следует ли эта система «нескольким аллелям больших эффектов» или «множеству аллелей малых эффектов», и прояснить роль постоянных генетических вариаций в адаптивном процессе.

Изменения окружающей среды, вызванные деятельностью человека, такие как загрязнение и изменение климата, предоставляют уникальные возможности для изучения процесса местной адаптации и его генетических признаков.Эти сдвиги обычно связаны с эволюцией сложных признаков 25–27 и полигенной адаптацией 5,10,28–30 , что затрудняет идентификацию соответствующих адаптивных аллелей. Однако есть хорошие примеры генетической основы полигенной адаптации к антропогенной деятельности, включающей множество физиологических признаков и генных путей 30,29 . Антропогенное загрязнение почв тяжелыми металлами может также вызвать серьезные экологические изменения и предложить сильный отбор, ведущий к изменению сложных характеристик, поскольку он, как правило, включает множество стрессоров, которые влияют на различные физиологические реакции и легко приводят к летальному исходу 31,32 .Кроме того, несмотря на то, что высокие концентрации тяжелых металлов всегда токсичны из-за окислительного стресса, вызванного производством активных форм кислорода (АФК), некоторые тяжелые металлы, такие как цинк, железо и медь, являются важными микроэлементами и необходимы в небольших количествах для правильное функционирование клеток 33,34 . Следовательно, эти металлы не могут быть полностью исключены из клеток, и жесткие системы регулирования обеспечивают баланс между вредным избытком и дефицитом тяжелых металлов 33,35,36 .Системы гомеостаза металлов основаны на четырех основных сопутствующих стратегиях: исключение металлов, хранение, иммобилизация и детоксикация ROS 35,37 . Исключение и хранение металлов достигается за счет трансмембранных белков-переносчиков, которые отвечают за перемещение ионов металлов через мембраны и импорт или вытеснение ионов металлов в / из клетки или в мембраносвязанные везикулы или вакуоли. Иммобилизация металлов осуществляется хелатирующими агентами, которые связываются с ионами металлов и инактивируют их. Наконец, детоксикация ROS происходит, когда антиоксиданты снижают окислительный стресс, вызванный ROS, вырабатываемой в ответ на высокое содержание металлов в клетках.Учитывая, что исключение металлов, их хранение, иммобилизация и детоксикация АФК основаны на действии множества различных генов и функций, геномные сигнатуры адаптации к тяжелым металлам, вероятно, являются полигенными, с низкой дифференциацией в большом количестве аллелей с довольно небольшими эффектами во многих пути регуляции металлов. Вдобавок, наряду с аллельной дисперсией, также известно, что толерантность к тяжелым металлам достигается за счет различий в количестве копий генов, с толерантными и нетолерантными индивидуумами, несущими разное количество копий специфических адаптивных аллелей 38 .

Несмотря на повсеместное присутствие грибов в почве и известные примеры устойчивости грибов к тяжелым металлам 39–42 , очень мало известно о генетической основе адаптации грибов к загрязнению металлами. Мы стремимся восполнить этот пробел, исследуя эволюцию толерантности к тяжелым металлам у Suillus luteus (Boletales, Basidiomycota), микоризного почвенного гриба, связанного с соснами (рис. 1). Известно, что виды рода Suillus устойчивы к почвам, загрязненным тяжелыми металлами 43,44 , и предыдущие исследования показали выраженную устойчивость к тяжелым металлам у S.luteus . В частности, было обнаружено, что изоляты из районов Бельгии, загрязненных тяжелыми металлами, более устойчивы к высоким уровням кадмия и / или цинка, в то время как изоляты из близлежащих незагрязненных районов с меньшей вероятностью выживут при высоких концентрациях металлов 41,45–50 . В отличие от нетолерантных изолятов, устойчивый к металлам S. luteus хорошо растет при высоких концентрациях кадмия и цинка, накапливая при этом удивительно низкие количества металлов в своих тканях, что указывает на резкие различия в гомеостазе металлов у устойчивых к металлу и нетолерантных изолятов.Целевые генетические исследования тех же бельгийских изолятов S. luteus выявили четыре гена-транспортера, предположительно участвующих в гомеостазе цинка ( SlZRT1, SlZRT2, SlZnT1 и SlZnT2 ) 45,51,52,53 , что позволяет предположить, что эти гены играют роль важная роль в переносимости загрязненных участков. Выживание на почвах с несколькими загрязнителями, такими как цинк и кадмий, также предполагает, что у S. luteus есть несколько стратегий для поддержания гомеостаза тяжелых металлов в условиях высокого содержания металлов.

Рисунок 1

(A) Suillus luteus , микоризный гриб, ассоциированный с соснами (фото Ноя Сигеля). (B) Ломмель, один из отобранных загрязненных участков (фото Йоске Рютинкса). (C) Отобранные участки в Бельгии (район Лимбург): три загрязненных тяжелыми металлами (черные кружки) и три незагрязненных участка (пустые кружки). B-Bilzen, Ds-Dilsen-Stokkem, E-Eksel, L-Lommel, N-Neerpelt, P-Paal. (Значок медеплавильного завода http://chittagongit.com/icon/factory-icon-transparent-6.html).

Мы исследовали эволюцию адаптации к тяжелым металлам в S.luteus путем сравнения полных геномов изолятов из загрязненных и соседних незагрязненных участков в Бельгии (рис. 1). На основании поразительных наблюдаемых различий в толерантности к металлам у изолятов из такого небольшого географического региона 48,54 , мы выдвинули гипотезу, что (1) люди из двух типов почв имеют общую низкую геномную дифференциацию, (2) толерантность к тяжелым металлам проистекает из дифференциации в многие аллели с небольшими эффектами присутствуют во всей популяции и (3) дифференцировка наиболее высока в генах, участвующих в гомеостазе металлов.Мы не обнаружили популяционной структуры и очень низкого расхождения между изолятами из двух типов почв, что согласуется с продолжающимся потоком генов и одной ауткроссинговой популяцией. Мы также обнаружили признаки полигенной адаптации, при этом многие локусы и генные пути демонстрируют как аллельную дивергенцию, так и вариацию числа копий. Как и ожидалось, многие дифференцированные гены участвовали в функциях исключения металлов, хранения, иммобилизации и детоксикации ROS. Эти результаты указывают на зарождающуюся местную адаптацию с постоянной генетической изменчивостью, включая аллели, выгодные в загрязненных почвах, которые находятся под положительным отбором у S.luteus , подверженный сильному загрязнению тяжелыми металлами.

Результаты

Отсутствие

Suillus luteus популяционная структура на загрязненных и незагрязненных участках

Анализ всего генома не предоставил доказательств структуры популяции на выбранных участках или типе почвы (рис. 2). Этот результат подтверждает предыдущий анализ фрагментов 48 и предполагает продолжающийся поток генов между изолятами из загрязненных и незагрязненных участков. Анализ ~ 1,6 миллиона высококачественных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), полученных путем сравнения 38 S.luteus (подробности см. в таблице S1) выявили одну популяцию как наиболее вероятное объяснение данных генетического варианта (рис. S1) и не показали кластеризации изолятов на основе загрязнения участка или почвы (рис. 2). Четыре из девяти изолятов из сайта Lommel не попали в кластер с основной группой изолятов в этом анализе (рис. 2), тогда как другие пять изолятов сгруппировались с остальными изученными изолятами. Такое несоответствие может отражать интрогрессию генетического материала из близлежащих популяций, однако мы не можем проверить эту гипотезу.Сводная статистика окна геномной изменчивости также соответствовала одной популяции и текущему потоку генов по всем выборочным участкам. Мы нашли сопоставимые оценки нуклеотидного разнообразия (π) для всех образцов (0,00649), для изолятов из загрязненных участков (0,00645) и изолятов из незагрязненных участков (0,00650), а также получили отрицательное значение D Таджимы (= -0,29696), наводит на мысль о прошлом узком месте.

Рисунок 2

Отсутствие популяционной структуры у изолятов S. luteus .Анализ основных компонентов на основе ~ 1,6 миллиона SNP из геномов, отобранных на загрязненных тяжелыми металлами (черные кружки) и незагрязненных (пустые кружки) сайтах в Бельгии.

Низкая общая аллельная дивергенция, при этом наиболее дивергентные области идентифицированы как трансмембранные переносчики

Мы обнаружили низкую геномную дивергенцию по всем геномам изолятов из загрязненных и незагрязненных почв. Этот результат согласуется с одной панмиктической популяцией и продолжающимся потоком генов. Геномная дифференцировка включала множество аллелей, разбросанных по геному, и обогащалась трансмембранными переносчиками.Мы измерили геномную дивергенцию, вычислив разницу частот аллелей (F ST ) и среднее количество нуклеотидных различий (d XY ) на окна размером 5 килобайт, и обнаружили, что оба они в целом низкие (среднее значение F ST = 0,003, рис. 3A , среднее значение d XY = 0,001, рис. S2). Анализ обогащения онтологией генов (GO) на 5% верхних дифференцированных областей генома на основе F ST и d XY выявил наиболее репрезентативные категории генов, предположительно дифференцирующих образцы из загрязненных и незагрязненных почв.Мы обнаружили, что в 5% лучших вариантов включены гены с функциями, связанными с толерантностью к тяжелым металлам, включая исключение металлов, хранение, иммобилизацию и детоксикацию ROS. Около 20% наиболее сильно дифференцированных геномных областей F ST были значительно обогащены транспортными функциями, важными для исключения и хранения тяжелых металлов вне цитоплазмы 34,36,55–57 (рис. 3B, таблица S2 ). Верхние 5% областей d XY были по-разному обогащены, причем ~ 40% были представлены термином GO «активность протеинкиназы» (рис.S3). Несоответствие в обогащении d XY и F ST может быть объяснено тем фактом, что d XY учитывает аллельные различия, но не их частоту 58 , и может не улавливать участки генома при отборе в системе с потоком генов и положением. генетическая изменчивость (см. ниже). Примечательно, что ни один из генов, идентифицированных в предыдущих исследованиях ( SlZRT1 , SlZRT2 , SlZnT1 и SlZnT2 ), не участвовал в S. luteus толерантности к цинку 51,52 были в верхних 5% отклоненных windows, однако, значение F ST для SlZnT2 действительно попало в верхние 10% ( SlZnT2 F ST = 0.0200982).

Рисунок 3

(a) Средние значения F ST в геномных окнах размером 5 Кб между Suillus luteus из загрязненных и незагрязненных почв. Желтые точки показывают верхние 5% значений F ST . Локусы, участвующие в транспорте, показаны темно-фиолетовым цветом, хелаторы - синим, а антиоксиданты - светло-синим (подробности см. В таблице 1). Ранее изученные транспортеры цинка ( SlZnT1, SlRT2 и SlZnT2 , F ST для окна, содержащего SlRT1 , находится чуть ниже нуля), показаны красным.(b) Онтология генов (GO) обогащает термины в верхних 5% значениях FST с соответствующими процентными значениями.

Никакие генетические варианты не были достоверно связаны с почвой, загрязненной тяжелыми металлами

Мы провели общегеномное ассоциативное исследование (GWAS) для точного определения распространенных вариантов умеренных эффектов 59 и не смогли выявить какие-либо конкретные генетические варианты, в значительной степени связанные с тяжелыми металлами загрязнение. Мы использовали подход «случай / контроль», который сравнивал изоляты из загрязненных (случай) и незагрязненных (контроль) почв и оценивал значимость их ассоциации для каждого SNP.Мы не обнаружили значимых вариантов после поправки Бонферрони или перестановочного теста. Несмотря на то, что мы не обнаружили существенных различий (скорее всего, из-за небольшого размера нашей выборки 21 ), один из вариантов с верхними p-значениями (p = 1,54e −7 ) включал шесть SNP, расположенных в области промотора. Rab геранилгеранилтрансферазы (рис. 4). Этот белок взаимодействует с мембраной и, как предполагается, имеет сайт связывания цинка 60 , что предполагает связь между экспрессией этого гена и появлением в загрязненных сайтах.

Таблица 1

Дифференцированные гены, участвующие в стратегиях толерантности к тяжелым металлам (подробности см. В Таблице S4). Мы объединили стратегии исключения и хранения металлов, поскольку оба они включают трансмембранные переносчики.

Рисунок 4

Общегеномная ассоциация между SNP и типом почвы. Предполагается, что шесть SNP с наивысшими p-значениями (красным цветом две точки перекрываются, где указано 1,54e −07 , несущественно на основе поправки Бонферрони, где p = 1e −08 ) будут расположены в Промоторная область гена геранилгеранилтрансферазы Rab, цинк-связывающей трансферазы (красный цвет).Точки, соответствующие SNP в кодирующей последовательности гена, указаны нижней стрелкой.

Гены с высокой вариабельностью числа копий участвуют в транспортной активности

Мы обнаружили широкую вариацию числа копий генов по всему геному, при этом ~ 40% наиболее высокодифференцированных генов участвуют в транспортной активности (рис. 5). Этот результат указывает на то, что многие гены вносят вклад в общую толерантность к тяжелым металлам за счет как умножения, так и делеции генов. Анализ обогащения онтологии генов вариантов с наибольшим числом копий 5% выявил транспортеры как наиболее представленную категорию, дифференцирующую изоляты из загрязненных и незагрязненных участков (рис.5B, таблица S3). Высокодифференцированные варианты также включали гены с другими функциями, связанными с гомеостазом тяжелых металлов (Таблица 1). Делеции и размножения генов происходили на обоих типах почв, при этом не было четкой картины, связанной с колонизацией загрязненных и незагрязненных почв (рис. 6).

Рис. 5

(a) Средняя вариация числа копий гена в геномных окнах размером 5 КБ между Suillus luteus из загрязненных и незагрязненных почв. Желтые точки показывают верхние 5% значений вариабельности копий гена.Гены, участвующие в транспорте, показаны темно-фиолетовым цветом, хелаторы - синим, а антиоксиданты - светло-синим (подробности см. В таблице 1). Изученные ранее переносчики цинка ( SlZnT1, SlZnT2 , SlRT1 , SlRT2 ) показаны красным. (b) Онтология генов (GO) обогащает термины в верхних 5% значениях FST с соответствующими процентными значениями.

Рисунок 6

Вариация числа копий гена в 5% верхних генов, участвующих в толерантности к тяжелым металлам. Тепловая карта генов (строк) с количеством копий каждого изолята (столбцы) между загрязненными и незагрязненными участками.Внизу справа: цветовой ключ номера копии гена.

В соответствии с предыдущими результатами 61 , мы идентифицировали изоляты из незагрязненных почв с множественными копиями SlZnT2 , которые, вероятно, являются устойчивыми к цинку (обнаружены в верхних 10% наших оценок вариации числа копий и, как было показано, коррелируют с устойчивостью к цинку 53 ), а также изоляты с низким числом SlZnT2 копий (продемонстрированы чувствительные к высокому содержанию цинка 53 ), обитающие на загрязненных почвах (рис.6). Эти результаты могут быть связаны с существованием неоднородности почвы 54 с локализованными более низкими уровнями загрязнения почвы, которые могут способствовать росту нетолерантных изолятов. Эти результаты также согласуются с продолжающимся потоком генов между загрязненными и незагрязненными участками и постоянными генетическими вариациями, включая варианты, связанные с устойчивостью к металлам. Основываясь на наших данных, мы не можем определить, присутствовала ли текущая наблюдаемая постоянная генетическая изменчивость до загрязнения или возникла в результате распространения толерантных генотипов из загрязненных территорий через поток генов.

Suillus luteus Гены-кандидаты на толерантность к тяжелым металлам

Из 5% наиболее дифференцированных генов для вариантов аллелей и копий мы идентифицировали 47 генов-кандидатов, разбросанных по геному, предположительно участвующих в толерантности к тяжелым металлам (Таблица 1 и Таблица S4) . Эти гены-кандидаты кодируют трансмембранные транспортеры, участвующие в исключении и хранении металлов, иммобилизации и детоксикации ROS. Большое количество генов-кандидатов, связанных с гомеостазом металлов, предполагает умеренный вклад отдельного гена в толерантность к тяжелым металлам у S.luteus . Пятнадцать генов-кандидатов участвовали в исключении и хранении металлов, при этом было предсказано, что четыре гена будут активно перекачивать ионы металлов через мембраны, расположенные либо в плазматической мембране (способствующей вытеснению металлов наружу клетки), либо в мембранах везикул и вакуолей (создавая хранение металлов, которое может быть либо хранится в ячейке, либо выдавливается). Примеры этих генов включают транспортные белки, способствующие диффузии катионов, которые, как предполагается, способствуют гомеостазу ионов цинка 34 , и ген пермеазы железа, который, как предполагается, переносит ионы железа через мембраны, но также сообщается о взаимодействии с другими металлами, такими как цинк и кадмий 33 , 37 .Мы обнаружили намного больше генов, участвующих в мембранном транспорте, исключении и хранении металлов (Таблица 1), однако неясно, как именно они способствуют толерантности к тяжелым металлам у S. luteus . Мы также обнаружили восемь генов, кодирующих хелатирующие агенты, которые отвечают за иммобилизацию металлов и предотвращение окислительного стресса 34 , включая три S-аденозил-L-метионин-зависимые метитрансферазы, которые участвуют в синтезе хелатора кадмия никотианамина 33,42 .Кроме того, мы обнаружили 24 гена, участвующих в детоксикации АФК. К ним относятся глутатион-S-трансфераза, ключевой игрок в снижении окислительного стресса, вызванного токсичностью тяжелых металлов 62 , и пятнадцать локусов, предсказанных как цитохром p450, семейство белков, которые, как известно, участвуют в детоксикации загрязнителей окружающей среды 63 .

Обсуждение

Мы исследовали геномы особей S. luteus из близлежащих загрязненных тяжелыми металлами и незагрязненных почв и не нашли доказательств популяционной структуры (подтверждающей предыдущее исследование, основанное на фрагментном анализе 48 ) и высоких уровней общие генетические вариации.Мы также обнаружили, что дифференциация аллелей и копий генов распространяется по геному, включая многие гены, связанные с гомеостазом металлов. Эти результаты согласуются с зарождающейся местной адаптацией, с продолжающимся потоком генов и постоянной генетической изменчивостью, включая многие локусы, незначительно влияющие на толерантность к тяжелым металлам.

На выявленные закономерности, вероятно, влияют несколько факторов, а именно недавнее загрязнение (~ 150 лет), отсутствие барьеров между загрязненными и незагрязненными почвами и способность некоторых устойчивых к металлам и чувствительных изолятов сохраняться в незагрязненных и незагрязненных почвах. загрязненные почвы 61 .Такое взаимное присутствие толерантных и чувствительных изолятов в обоих типах почв, вероятно, связано как с отсутствием сильного компромисса между устойчивостью к металлам и выживанием в незагрязненной почве, так и с возникновением очагов с низким уровнем загрязнения на загрязненных участках, которые позволяют изоляты сохраняться. Модель отбора S. luteus с низкой общей дивергенцией контрастирует с другими системами, демонстрирующими локальную адаптацию, которые демонстрируют четкую популяционную структуру и несколько аллелей с основными эффектами, определяющими дивергенцию 14,16,17,29 .Однако есть и другие сообщения о локальной адаптации без популяционной структуры, низкой геномной дивергенции и многих генов с небольшими эффектами. Например, было обнаружено, что местная адаптация устриц к низкой и высокой солености включает единственную популяцию с высоким уровнем ауткроссинга с общей низкой дивергенцией из-за отсутствия барьеров для потока генов и небольшим вкладом в приспособленность аллелей, определяющих толерантность к соли 74 . Ожидается, что местная адаптация приведет к дифференциации популяции только в том случае, если отбор в новой среде будет достаточно серьезным, чтобы предотвратить выживание генотипов, лишенных специфических адаптивных аллелей 6 и / или отсутствия потока генов, гомогенизирующего генофонд 23 .Учитывая общую постоянную генетическую изменчивость, отсутствие барьеров для потока генов в разных типах почвы и потенциальную неоднородность химического состава почвы, очень маловероятно, что этот сценарий зарождающейся локальной адаптации у S. luteus эволюционирует в популяционную дифференциацию или видообразование. в будущем.

Известно, что адаптация к высокотяжелым металлам происходит как при аллельной дивергенции, так и при вариации числа копий гена, с толерантными и нетолерантными индивидуумами, несущими разные адаптивные аллели 29,75 и / или разные адаптивные аллели с числом копий 38 .Например, толерантность к меди у дрожжей достигается за счет мутации как аллеля, так и изменения числа копий в генах, принадлежащих к ряду ферментативных путей, особенно связанных с хранением металлов и включающих гены вакуолярного транспорта 76 . Также было документально подтверждено, что вариация числа копий гена придает толерантность к кадмию в популяциях растения Noccaea caerulescens 77 и толерантность к цинку и кадмию в популяциях Arabidopsis halleri 75 S. luteus постоянная генетическая изменчивость включала вариацию как аллеля, так и количества копий гена, где варианты, обеспечивающие более высокую приспособленность в новой среде, присутствуют с низкой частотой во всей популяции 78 . Хотя эти общие варианты не являются выгодными в исходной среде, они позволяют людям колонизировать и выживать в новых условиях окружающей среды 6 . Широко распространенная генетическая изменчивость также очевидна у S.luteus посредством общей дифференциации очень низкого аллеля и числа копий между изолятами из разных типов почвы и адаптивных аллелей, присутствующих в изолятах в популяции, как и ожидалось по теории 78 . Конкретным примером является ген SlZnT2 , с большим числом копий, который, как известно, связан с устойчивостью к цинку 53 , присутствующий в изолятах как из загрязненных, так и незагрязненных почв.

Дифференциация между изолятами S. luteus из загрязненных и незагрязненных почв включала множество аллелей умеренных эффектов, при этом мишени отбора широко распределены по геному и различные генетические комбинации, обеспечивающие способность сохраняться в загрязненных почвах.Этот последний результат подтверждает предыдущие экспериментальные исследования, показывающие, что устойчивые к металлам изоляты демонстрируют несколько различных генотипов 53 . Кроме того, гены транспортеров цинка SlZnT1 и SlZnT2 , которые не были включены в 5% лучших генов-кандидатов при отборе, были экспериментально задокументированы как участвующие в толерантности к цинку 45,52 , что указывает на то, что гены, в первую очередь, не нацелены на выбор также способствует толерантности к тяжелым металлам. Такая полигенная адаптация является обычным явлением и сообщается в системах с отбором, воздействующим на комплексные признаки, такие как устойчивость к температуре, загрязнителям и серпентиновым почвам.Например, рыба-килл, подвергшаяся воздействию повышенной температуры воды 28 и смеси загрязняющих веществ 79 , развила толерантность через дифференциацию многих различных генов, связанных с множеством физиологических реакций, и разными генотипами, придающими толерантность к новой среде 79 . Точно так же североатлантические угри при воздействии пестицидов и тяжелых металлов показали дифференцировку, происходящую по аллелям многих генов в различных путях, участвующих в регуляции стеролов 29 .Полигенная адаптация также известна для культурной кукурузы и была ключом к успеху приручения во многих различных средах Северной Америки 9 . Наконец, серпентиновые почвы являются хорошо известным примером сложных экологических стрессов, которые способствовали полигенной адаптации у Arabidopsis , включая устойчивость к засухе и высоким концентрациям тяжелых металлов 80 . Исследуемая популяция S. luteus подвержена воздействию нескольких тяжелых металлов и, вероятно, также воздействию других абиотических факторов (таких как изменение pH, влияющих на биодоступность ионов металлов), которые влияют на ее способность сохраняться в загрязненных почвах 41 .Следовательно, полигенная адаптация - это ожидаемая реакция на загрязнение тяжелыми металлами.

Загрязнение почвы тяжелыми металлами, как известно, определяет эволюцию организмов 31 , а устойчивость к тяжелым металлам, как известно, вовлекает гены во множество путей 35,36 . Как и у большинства других организмов, толерантность к металлу Suillus luteus достигается путем отбора, действующего на многие гены, участвующие в гомеостазе металлов, в частности, в стратегиях исключения, хранения, иммобилизации металлов и детоксикации АФК.Исключение и хранение металлов осуществляется трансмембранными переносчиками, которые регулируют движение ионов металлов через плазматические мембраны и мембраны органелл, активно исключая токсичные металлы из цитоплазмы. Иммобилизация металлов происходит под действием хелатирующих агентов. У грибов они могут происходить как снаружи, так и внутри клетки, например, гидрофобины и меланины связывают металлы с клеточной стенкой грибов 37 , а никотианамин играет ключевую роль в поддержании гомеостаза ионов металлов в клетке 81–83 .Детоксикация ROS происходит, когда антиоксиданты (например, супероксиддисмутазы, железоредуктазы, цитохром p450 и S-трансферазы глутатиона 62,72,73 ) снижают окислительный стресс, вызванный ROS, продуцируемыми в ответ на высокое содержание металлов в клетке, защищая клетку. от окислительного повреждения, вызванного ионами тяжелых металлов 79 . Эти стратегии действуют вместе и, как ожидается, будут происходить в разных частях гифы гриба (рис. 7). Основная стратегия допуска металла в S.luteus - это исключение / хранение металлов, с белками-переносчиками в качестве основных мишеней отбора. Известно, что трансмембранные транспортеры имеют решающее значение для толерантности к тяжелым металлам 34 , а дифференцированные транспортеры включают транспортер, способствующий диффузии катионов, и другие транспортеры, участвующие в транспорте металлов также в растениях и дрожжах, такие как белок ZIP (Zrt-, Irt-like Protein) Семейство транспортеров 34,55 , которое транспортирует микроэлементы 57 через мембраны к клетке и органеллам и от них.Примечательно, что четыре транспортера, которые ранее были вовлечены в гомеостаз цинка, не входили в число наиболее высокодифференцированных генов. Это были два гена-импортера цинка плазматической мембраны в семействе ZIP (Zrt-, Irt-like Protein) 45,51 и два посредника диффузии катионов (CDF), участвующие в хранении цинка в вакуоли 52,53 . Функциональные анализы показали, что транскрипция SlZRT1 значительно снижается, когда S. luteus подвергается воздействию токсичных концентраций цинка 45 и гетерологичная экспрессия в дрожжах, а анализы транскрипции SlZRT2 предполагают, что этот ген участвует в перераспределении цинка внутри сотовый 51 .Кроме того, вакуолярная локализация и цинковая специфичность SlZnT1 были подтверждены гетерологичной экспрессией гена в дрожжах. Кроме того, было обнаружено, что повышенная толерантность к цинку коррелирует с увеличением числа копий SlZnT2 53 , что позволяет предположить, что этот ген важен для придания толерантности к высоким концентрациям цинка.

Рисунок 7

Модель толерантности к тяжелым металлам в S. luteus , включая исключение металлов, хранение, иммобилизацию и детоксикацию.(1) Исключение / хранение. Поглощение ионов тяжелых металлов из почвы происходит через переносчики, расположенные в плазматической мембране, которые можно регулировать для регулирования притока металлов. Токсичность тяжелых металлов вызывает выброс хелатирующих агентов за пределы клеточной стенки, что также ограничивает поступление ионов металлов. (2) Иммобилизация. Попадая в клетку, ионы металлов могут хелатироваться в цитозоле или активно закачиваться в везикулы и / или вакуоль трансмембранными переносчиками. Захваченные ионы либо накапливаются, либо перемещаются в везикулах к плазматической мембране и вытесняются из клетки.(3) Детоксикация АФК - Антиоксиданты снимают окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода (АФК), посредством восстановителей, таких как редуктазы или мембранные белки, такие как Cytochromes p450. В таблице 1 показан список генов-кандидатов, предположительно участвующих в толерантности к металлу S. luteus по функциональным категориям. (S = Spitzenkoerper; ER = эндоплазматический ретикулум; G = аппарат Гольджи; V = везикула / грибковая вакуоль; N = ядро; M = митохондрия).

Многие гены-кандидаты были связаны с иммобилизацией металлов, включая S-аденозил-L-метионинметилтрансферазы, которые являются известными компонентами синтеза никотианамина 82 , выдающегося хелатирующего агента кадмия в грибах 42,82 .Гены-кандидаты также попали в категорию детоксикации металлов, являющуюся общим и необходимым компонентом реакции клеток на стресс 36 . Известно, что большинство дифференцированных генов-кандидатов на детоксикацию участвуют в общих стрессовых реакциях и не участвуют конкретно в гомеостазе металлов, таких как супероксиддисмутаза марганца / железа и глутатион-S-трансфераза. Этот результат является ожидаемым, поскольку клетки обладают всеобъемлющими ответами, которые защищают от окислительного стресса, вызванного многими факторами, включая воздействие тяжелых металлов 79 .Действительно, пятнадцать из выбранных нами генов-кандидатов были аннотированы как Cytochromes p450, многочисленное семейство ферментов, присутствующих во всех царствах. Эти мембранные белки выполняют множество функций, в том числе действуют как антиоксиданты и придают толерантность к загрязнителям у многих организмов 63,84 .

В заключение, наши результаты показывают, что S. luteus претерпевает зарождающуюся локальную адаптацию к загрязнению тяжелыми металлами, управляемую многими генетическими вариантами небольших эффектов.Варианты проистекают из постоянной генетической изменчивости, причем как аллельный полиморфизм, так и полиморфизм числа копий придают устойчивость к загрязнению почвы тяжелыми металлами. Мы также обнаружили, что толерантность S. luteus к тяжелым металлам основана на нескольких стратегиях гомеостаза металлов (исключение, хранение, иммобилизация и детоксикация ROS), которые включают комбинацию генов и путей. Гены-кандидаты, участвующие в трансмембранном транспорте металлов, были основными мишенями отбора тяжелых металлов, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить роль всех генов-кандидатов в толерантности к металлам.Учитывая микоризную привычку S. luteus , будущие исследования также должны быть сосредоточены на взаимодействии между устойчивостью грибов к металлам и их сосновыми партнерами, чтобы лучше понять, как адаптация к окружающей среде происходит у симбиотических организмов.

Методы

Сбор культур, выделение ДНК и секвенирование

Suillus luteus культур были получены из плодовых тел (грибов), собранных в загрязненных тяжелыми металлами и незагрязненных местах в Бельгии (рис.1, таблица S1). Шесть населенных пунктов (три загрязненных и три незагрязненных) были посещены в разное время во время кампаний по отбору проб с осени 1998 года по осень 2016 года. Загрязненные участки в основном богаты цинком и кадмием и, в меньшей степени, медью, свинцом и мышьяком. 54,85 ​​. Источником загрязнения являются выведенные из эксплуатации цинковые заводы, созданные ~ 150 лет назад 54 . Плодовые тела собирали на расстоянии не менее 10 м друг от друга, чтобы гарантировать выборку различных генов и изолировать в культуре.Изоляты поддерживали в университете Хасселта на твердой модифицированной среде Фриса, идеально подходящей для выращивания микоризных грибов. Мы отобрали 18 изолятов S. luteus из незагрязненных и 20 из загрязненных почв, варьируя от четырех до восьми изолятов на каждое место отбора (рис. 1). Мы экстрагировали ДНК из культивированного мицелия каждого изолята, используя протокол CTAB / фенол / хлороформ (модифицированный из Liao, et al. 86 ). Полные геномы были секвенированы с помощью технологии Illumina на модели HiSeq-2500 1 ТБ, спаренный конец с размером вставки 600 п.н., в Объединенном институте генома, и необработанные считывания доступны в архиве для кратких считываний (таблица S5).

Фильтрация считывания, картирование, охват генома и вызов вариантов.

Последовательности были очищены путем обрезки считываний низкого качества и удаления загрязняющих веществ. Необработанные чтения фильтровались с помощью BBmap в пакете BBTools 87 . Мы отсекли все известные последовательности адаптеров Illumina, отбросили чтения с более чем 0 неоднозначными основаниями (Ns) и короче 41 оснований после обрезки. Считанные пары отбрасывались, если после обрезки обе были короче 0,33 от исходной длины. Сохраненные показания сравнивались с базами данных «человек», «кошка», «собака», «мышь» и «микробы» для удаления потенциальных загрязнений.

Мы сопоставили показания каждого отдельного образца с эталонным геномом Suillus luteus 88 (размер = 44,49 Мб), используя Bowtie2 89 . Мы отсортировали сопоставленные выравнивания в Picard по геномной координате и использовали ту же программу для добавления групп чтения на основе информации о считывании и прогоне Illumina (таблица S5), а также для удаления дубликатов ПЦР. Мы рассчитали средний охват на геном, используя инструмент глубины покрытия в GATK 90 . Мы вызывали варианты в GATK с использованием вызывающего гаплотипа в режиме gvcf.Все образцы были генотипированы вместе, и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) были определены с помощью инструмента GenotypeGVCF GATK. Мы удалили недвойственные SNP в GATK, а также все SNP с охватом более 200 или менее 5 с минимальным качеством выше 30 с помощью VCFTools 91 . Используя пакет egglib 92 на Python, мы взяли высококачественные SNP и эталонный геном и создали файлы fasta с собственными скриптами (доступны по адресу: https://github.com/abazzical/sluteus.2019) для каждого образца.

Структура населения и сводная статистика

Мы исследовали существование структуры населения, используя fastSTRUCTURE 93 (указав K как '1', '2', '3', '4' и '38') и выполнив анализ основных компонентов, реализованный в R-пакете SNPrelate 94 . Мы рассчитали сводную статистику по всей популяции и группам изолятов из загрязненных и незагрязненных мест. Мы вычислили D и Tajima в пакете Python для sci-kit allel 95 .

Меры аллельной дивергенции и общегеномная ассоциация случай / контроль

Для выявления генов, важных для устойчивости к тяжелым металлам, мы исследовали аллельную дивергенцию между изолятами из загрязненных и незагрязненных почв. Мы рассчитали разницу частот аллелей (F ST ) с помощью VCFTools 91 и среднее количество нуклеотидных различий (d XY ) с помощью пакета egglib 92 , реализованного на Python. Мы оценили как F ST , так и d XY в геномных окнах 5kb.Мы также реализовали анализ ассоциации по всему геному, чтобы оценить, были ли определенные варианты в значительной степени связаны с появлением в загрязненных почвах. Мы исследовали SNP, связанные с загрязненными почвами, выполнив исследование ассоциации случай / контроль по всему геному в PLINK 59 , оценив изоляты из загрязненных почв как «случай» и изоляты из незагрязненных почв как «контроль». Мы скорректировали p-значения, используя поправку Бонферрони и тест перестановки с 1000 повторов в PLINK 96 .

Оценки числа копий на изолят и вариации числа копий

Для выявления потенциальных генов, участвующих в толерантности к тяжелым металлам, на основе вариации числа копий, мы оценили число копий каждого гена для каждого изолята. Мы использовали программное обеспечение Control-FreeC 97 для оценки количества копий на основе чистых считываний каждого изолята. Мы предположили диплоидность наших образцов и последовали Steenwyk, et al. 98 протокол (подробные настройки см. В дополнительных методах и на GitHub: https: // github.com / abazzical / sluteus.2019). Control-FreeC оценил количество копий для окон 250 базовых пар. Чтобы идентифицировать варианты числа копий между изолятами в популяции из загрязненных и незагрязненных почв, мы измерили величину дисперсии в копиях (V ST ), следуя Steenwyk, et al. 98 .

Анализ обогащения онтологии генов

Мы выполнили анализ обогащения GO, чтобы выявить термины GO, значительно обогащенные в наиболее расходящихся регионах в S.luteus из загрязненных и незагрязненных почв. Мы использовали термины генной онтологии (GO) на основе аннотированного эталонного генома Suillus luteus 88 . Мы исследовали 5% наиболее дифференцированных генов по трем критериям дивергенции, F ST , d XY и вариациям числа копий. и использовали приложение Cytoscape 99 ClueGO 100 для описания функций генов. Мы провели отдельный анализ для каждой меры дивергенции, используя настройки по умолчанию, и провели поиск обогащенных кластеров категории GO «биологические процессы» 101 .Мы установили значимость обогащения терминов GO путем реализации статистики ClueGO с использованием двустороннего гипергеометрического теста и скорректированных p-значений Бенджамини-Хохберга.

Благодарности

Эта работа была поддержана Научной программой Сообщества Объединенного института генома (награда JGI 502931 для NN) и грантом NSF DEB-1554181 (для RV). JVC и JR финансировались Исследовательским фондом Фландрии (проект FWO G079213N для JVC) и Vrije Universiteit Brussel (стартовый грант JR). LC был поддержан стипендией PhD по инновациям и предпринимательству Фландрии (проект IWT 141461).SB был поддержан Сельскохозяйственной экспериментальной станцией Монтаны. NN была поддержана Гавайской экспериментальной сельскохозяйственной станцией. Мы благодарим P. Gladieux за помощь в анализе данных, G. Bindea за ее помощь во включении Suillus luteus в ClueGO и H-L. Ляо за полезные комментарии к рукописи.

(PDF) Протеомный анализ гемолимфы, тела гриба и антенны дает новое представление об устойчивости пчел к заражению варроа

24

Чувствительная гигиена.Журнал пчеловодства 2009, 48, (3), 156-161.

19. Рейтер, М.С. а. Г. С. Показатели гигиены пчелиных семей на коммерческой пасеке.

Apidologie 1998 29, 291-302.

20. Boutin, S .; Альбураки, М .; Mercier, P.L .; Giovenazzo, P .; Дером, Н., Дифференциальная экспрессия генов

между гигиеническими и негигиеническими ульями медоносных пчел (Apis mellifera L.). BMC Genomics 2015, 16, 500.

21. Le Conte, Y .; Alaux, C .; Мартин, Дж.F .; Harbo, J. R .; Harris, J. W .; Dantec, C .; Severac, D .; Cros-Arteil,

S .; Навахас М. Социальный иммунитет медоносных пчел (Apis mellifera): транскриптомный анализ

варроа-гигиенического поведения. Насекомое Mol Biol 2011, 20, (3), 399-408.

22. Navajas, M .; Migeon, A .; Alaux, C .; Martin-Magniette, M .; Робинсон, G .; Evans, J .; Cros-Arteil, S .;

Crauser, D .; Ле Конте, Ю., Дифференциальная экспрессия гена медоносной пчелы Apis mellifera, связанная с инфекцией

Varroa destructor.BMC Genomics 2008, 9, 301.

23. Fang, Y .; Feng, M .; Han, B .; Ци, Й .; Хм.; Fan, P .; Хо, X .; Meng, L .; Ли, Дж., Протеомный анализ

раскрывает механизм, лежащий в основе эмбриогенеза трутня медоносной пчелы и его расхождения с

рабочим (Apis mellifera lingustica). J Proteome Res 2015, 14, (9), 4059-71.

24. Fang, Y .; Feng, M .; Han, B .; Лу, X .; Рамадан, Х .; Ли, Дж., Углубленная протеомическая характеристика эмбриогенеза

рабочих медоносных пчел (Apis mellifera ligustica).Mol Cell Proteomics 2014, 13, (9),

2306-20.

25. Qi, Y .; Fan, P .; Hao, Y .; Han, B .; Fang, Y .; Feng, M .; Cui, Z .; Ли, Дж., Фосфопротеомный анализ сетей фосфорилирования белков

в гипофарингеальной железе пчелоносцев (Apis mellifera

ligustica). J. Proteome Res 2015, 14, (11), 4647-61.

26. Hernandez, L.G .; Lu, B .; da Cruz, G.C .; Калабрия, Л. К .; Мартинс, Н. Ф .; Togawa, R .; Espindola, F. S .;

Йейтс, Дж.Р.; Cunha, R. B .; де Соуза М. В. Протеом мозга рабочей пчелы. J Proteome Res 2012, 11,

(3), 1485-93.

27. Guarna, M. M .; Melathopoulos, A. P .; Huxter, E .; Iovinella, I .; Parker, R .; Стойнов, Н .; Tam, A .;

Moon, K. M .; Chan, Q.W .; Pelosi, P .; Белый, R .; Pernal, S. F .; Фостер, Л. Дж., Поиск биомаркеров белка

связывает передачу обонятельного сигнала с социальным иммунитетом. BMC Genomics 2015, 16, 63.

28.Parker, R .; Guarna, M. M .; Melathopoulos, A.P .; Луна, К. М .; Белый, R .; Huxter, E .; Pernal, S. F .;

Фостер, Л. Дж., Корреляция изменений протеома с поведением социального иммунитета дает представление

о резистентности к паразитическому клещу Varroa destructor у медоносной пчелы (Apis mellifera). Геном Биол

2012, 13, (9), R81.

29. Бирнбаумер Л. Класс ионных каналов TRPC: критический обзор их роли в медленном, устойчивом

увеличении внутриклеточных концентраций Ca (2+).Annu Rev Pharmacol Toxicol 2009, 49, 395-426.

30. Mondet, F .; Alaux, C .; Severac, D .; Rohmer, M .; Mercer, A.R .; Ле Конте, Ю., Усики являются ключом к

гигиеническому поведению медоносных пчел, чувствительному к варроа. Sci Rep 2015, 5, 10454.

31. Richmond, J. E .; Броди, К. С., Цикл синаптических пузырьков: экзоцитоз и эндоцитоз у дрозофилы

и C. elegans. Curr Opin Neurobiol 2002, 12, (5), 499-507.

32. Спивак, М .; Мастерман, Р.; Ross, R .; Месче, К. А., Гигиеническое поведение медоносной пчелы (Apis

mellifera L.) и модулирующая роль октопамина. Журнал нейробиологии 2003, 55, (3), 341-354.

33. Menzel, R .; Джурфа М. Когнитивная архитектура мини-мозга: пчела. Trends in Cognitive

Sciences 2001, 5, (2), 62-71.

34. Greenberg, J. K .; Xia, J .; Чжоу, X .; Тэтчер, S. R .; Gu, X .; Ament, S.A .; Newman, T. C .; Грин, П. Дж .;

Чжан, В.; Робинсон, Г. Э .; Бен-Шахар Ю. Поведенческая пластичность медоносных пчел связана с

различиями в транскриптоме микроРНК головного мозга. Гены поведения мозга 2012, 11, (6), 660-70.

35. Chan, Q. W .; Фостер, Л. Дж., Изменения в экспрессии белка во время развития личинок медоносных пчел.

Страница 24 из 40

ACS Paragon Plus Environment

Journal of Proteome Research

1

2

3

4

5

6

7

8

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

0002 24

0002

0002

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

41

41

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56 90 003

57

58

59

60

Грибковые эндофиты Populus trichocarpa изменяют фенотип хозяина, экспрессию генов и состав ризобиома (Журнальная статья)

Ляо, Хуэй-Лин, Бонито, Грегори, Рохас, Дж.Алехандро, Хамид, Халид, Ву, Стивен, Шадт, Кристофер Уоррен, Лаббе, Джесси Л., Тускан, Джеральд А., Мартин, Фрэнсис М., Григорьев, Игорь В. и Вилгалис, Ритас. Грибковые эндофиты Populus trichocarpa изменяют фенотип хозяина, экспрессию генов и состав ризобиома . США: Н. п., 2019. Интернет. DOI: 10.1094 / MPMI-05-18-0133-R.

Ляо, Хуэй-Лин, Бонито, Грегори, Рохас, Дж.Алехандро, Хамид, Халид, Ву, Стивен, Шадт, Кристофер Уоррен, Лаббе, Джесси Л., Тускан, Джеральд А., Мартин, Фрэнсис М., Григорьев, Игорь В. и Вилгалис, Ритас. Грибковые эндофиты Populus trichocarpa изменяют фенотип хозяина, экспрессию генов и состав ризобиома . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1094/MPMI-05-18-0133-R

Ляо, Хуэй-Лин, Бонито, Грегори, Рохас, Дж.Алехандро, Хамид, Халид, Ву, Стивен, Шадт, Кристофер Уоррен, Лаббе, Джесси Л., Тускан, Джеральд А., Мартин, Фрэнсис М., Григорьев, Игорь В. и Вилгалис, Ритас. Мы бы . «Грибковые эндофиты Populus trichocarpa изменяют фенотип хозяина, экспрессию генов и состав ризобиома». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1094/MPMI-05-18-0133-R. https://www.osti.gov/servlets/purl/1509573.

@article {osti_1509573,
title = {Грибковые эндофиты Populus trichocarpa изменяют фенотип хозяина, экспрессию генов и состав ризобиомов},
автор = {Ляо, Хуэй-Лин и Бонито, Грегори и Рохас, Дж.Алехандро и Хамид, Халид и Ву, Стивен и Шадт, Кристофер Уоррен и Лаббе, Джесси Л. и Тускан, Джеральд А. и Мартин, Фрэнсис М. и Григорьев, Игорь В. и Вилгалис, Ритас},
abstractNote = {Роды Mortierella и Ilyonectria включают общие виды почвенных грибов, которые часто обнаруживаются как корневые эндофиты у многих растений, включая Populus spp. Однако экологическая роль этих и других эндофитных грибов в отношении роста и функционирования растений до сих пор не изучена.Функциональная экология двух ключевых таксонов ризобиома P. trichocarpa, M. elongata PMI93 и I. europaea PMI82, была изучена путем сочетания биотестов лесных почв с метатранскриптомикой окружающей среды. Используя эксперименты по биопробам почвы, дополненные грибковыми инокулянтами, было обнаружено, что M. elongata способствует росту P. trichocarpa. Этот ответ не зависел от сорта. Напротив, I. europaea не оказывала видимого влияния на рост P. trichocarpa. Метатранскриптомические исследования показали, что эти грибы влияют на ризофитную и эндофитную активность P.trichocarpa и вызвал сдвиги в микробных сообществах почвы и корней. Дифференциальная экспрессия ядерных генов в корнях P. trichocarpa наблюдалась в ответ на оба вида грибов. Экспрессия генов P. trichocarpa для передачи сигналов липидов и поглощения питательных веществ была усилена, а экспрессия генов, связанных с передачей сигналов гиббереллина, была изменена в растениях, инокулированных M. elongata, но не I. europaea. Повышенная регуляция генов для стимуляции роста, подавление генов для нескольких киназ рецепторов с высоким содержанием лейцина и изменение экспрессии генов, связанных с защитными реакциями растений (например,g., сигнальные пути жасмоновой кислоты, салициловой кислоты и этилена) также предполагают, что M. elongata манипулирует защитными механизмами растений, способствуя росту растений.},
doi = {10.1094 / MPMI-05-18-0133-R},
url = {https://www.osti.gov/biblio/1509573}, journal = {Молекулярные взаимодействия растений и микробов},
issn = {0894-0282},
число = 7,
объем = 32,
place = {United States},
год = {2019},
месяц = ​​{1}
}

границ | Перекрестный разговор между антигенпредставляющими клетками и Т-клетками влияет на гомеостаз кишечника, бактериальные инфекции и опухолеобразование

Введение в врожденный иммунитет, активацию APC и функцию Т-клеток

Иммунная система делится на врожденные и адаптивные реакции.Адаптивный иммунитет регулируется В-клетками и Т-клетками. Созревание Т-клеток происходит в тимусе, а созревание В-клеток - в костном мозге. Во время антиген-зависимой активации В-клетки могут развиваться в клетки памяти, которые активируются при последующем воздействии контактировавшего антигена, или плазматические клетки, которые секретируют антитела, специализированные для нацеливания на этот антиген (1). Точно так же Т-клетки могут развиваться в клетки памяти или эффекторные клетки. Двумя основными типами эффекторных Т-клеток, продуцируемых адаптивной иммунной системой, являются Т-хелперы (Т h ) и цитотоксические Т-клетки (Т C ).Клетки T h отличаются экспрессией CD4, субпопуляционной экспрессией факторов транскрипции (T-bet, GATA3 и RORγt) и высвобождением цитокинов, которые влияют на активацию и дифференцировку других иммунных клеток. Существуют три основных подмножества клеток T h (T h 1, T h 2 и T h 17), каждый из которых специализируется на защите от определенных инфекций. Клетки T h 1 в основном секретируют интерферон-γ (IFN-γ), который связан с защитой от внутриклеточных микробов (преимущественно вирусов) и началом анти- или про-онкогенных эффектов, T h 2 клетки борются с паразитарными инфекциями путем секретирующие специфические белки интерлейкина (IL), включая IL-4, IL-5 и IL-13, и клетки T h 17 борются с микробными патогенами, секретируя цитокины, такие как IL-17A, IL-17F и IL-22 (2 –6).Клетки T C отличаются экспрессией CD8 и способностью напрямую связываться с трансформированными и инфицированными клетками и уничтожать их (1, 7). Т-клетки и В-клетки действуют вместе, чтобы создать иммунологическую память против отдельных патогенов или раковых клеток. Для полного развития адаптивного иммунитета может потребоваться несколько дней, но после его активации возможен быстрый иммунный ответ при последующих контактах с конкретным патогеном или раковой клеткой. Врожденный иммунитет, в отличие от адаптивного иммунитета, традиционно не основан на иммунологической памяти.Однако некоторые врожденные клетки, особенно естественные клетки-киллеры (NK), способствуют развитию иммунологической памяти против вирусов. Например, NK-клетки Ly49H + , подвергшиеся воздействию цитомегаловируса мыши (MCMV), размножаются, вызывая первичный иммунный ответ (8). Этому процессу способствует передача сигналов IL-18 (9). Наивные мыши, получившие адоптивный перенос NK-клеток памяти, смогли дать сильный вторичный ответ при заражении MCMV (8). Однако передача сигналов IL-18 не требуется для ответа на повторение NK-клетками памяти (9).

Классические антигенпрезентирующие клетки (APC) представляют собой дендритные клетки (DC) и B-клетки (10). Чтобы вызвать иммунный ответ, APC должны сначала распознать и связать свою цель. Для этого APC экспрессируют антиген-специфические поверхностные рецепторы, включая рецепторы распознавания образов (PRR). PRR выявляют молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP), которые продуцируются микробами, и молекулярные паттерны, связанные с повреждениями (DAMP), которые продуцируются поврежденными или мутировавшими клетками-хозяевами (11). В зависимости от рецептора экспрессия PRR может быть конститутивной или индуцибельной (12, 13).Одно из основных семейств PRR - это Toll-подобные рецепторы (TLR). TLR обычно экспрессируются на поверхности клетки или внутри эндосом и представляют собой трансмембранные белки типа I, внеклеточные домены которых экспрессируют богатые лейцином повторы, которые используются для распознавания и связывания со специфическими PAMPs (14–16). Как только внеклеточный домен связывает свою мишень, TLR активирует цитозольный сигнальный каскад, который инициируется адаптерным белком, который взаимодействует с внутриклеточным доменом TLR. В зависимости от TLR могут быть активированы два набора адаптеров: TIRAP-MyD88 и TRAM-TRIF (14, 16–18).Другой группой PRR являются рецепторы, подобные домену связывания нуклеотидов и олигомеризации (NOD) (NLR). NLR присутствуют в цитоплазме и, как TLR, инициируют сигнальные каскады при связывании с микробными PAMP (14, 16). После связывания с соответствующими PAMP или DAMP, APC интернализируют свою мишень, инициируя фагоцитоз, пиноцитоз или клатрин-опосредованный эндоцитоз. Путь, по которому молекулы подвергаются эндоцитозу, определяет, как они будут расщепляться, а затем отображаться главным комплексом гистосовместимости (MHC) для распознавания Т-клеток (19, 20).

Два типа MHC отображают антигены: MHC класса I и MHC класса II. В то время как рецепторы MHC I продуцируются всеми ядросодержащими клетками и отображают эндогенные антигены для активации CD8 + T C , только APC продуцируют рецепторы MHC II для отображения экзогенных антигенов и активации клеток CD4 + T H . Некоторые APC, включая DC, также могут представлять экзогенные антигены рецептору MHC I, чтобы активировать CD8 + Т-клетки во время процесса, называемого перекрестной презентацией (20–23).Презентация антигенов рецепторами MHC I или MHC II также зависит от состава антигена (частицы или растворимые), метода эндоцитоза и деградации лизосомными протеазами (20). Клетки T C и T H используют мембраносвязанные рецепторы Т-клеток (TCR) для связывания рецепторов MHC (1). TCR состоят из двух полипептидных цепей (альфа и бета), связанных между собой дисульфидными связями. Т-клетки также продуцируют корецепторы на своей поверхности, что дополнительно способствует стабилизации взаимодействий с MHC APC.К ним относятся CD4 и CD8 (11, 20, 24). Костимулирующие взаимодействия между APC и Т-клетками также могут происходить, соответственно, между B7 и CD28, ICAM-1 и LFA-1, а также CD40 и CD40L (25, 26).

Иммунитет к бактериям

В этом разделе будет обсуждаться врожденный иммунитет в отношении комменсальных и патогенных бактерий. Во-первых, иммунитет будет рассмотрен в контексте комменсалов и их влияния на изменение активности T h 17 и регуляторных Т (T reg ) клеток.Затем будут обсуждаться взаимодействия APC с Т-клетками, в основном в отношении экспрессии различных TLR, для борьбы с патогенными инфекциями.

Иммунитет и бактериальные ассоциации

Микробиота кишечника состоит из всех архей, грибов, простейших, вирусов и бактерий, обитающих в желудочно-кишечном тракте. В частности, толстая кишка здорового мужчины от 29 до 30 лет со средним весом и ростом, по оценкам, содержит ~ 3,8 × 10 13 бактерий (27). Было показано, что комменсальные бактерии модулируют ответы иммунных клеток в кишечнике.В свою очередь, иммунные клетки взаимодействуют с субпопуляциями кишечного эпителия, чтобы регулировать колонизацию комменсальными бактериями. Однако считается, что измененный состав микробиоты и аберрантные иммунные ответы на комменсальные бактерии играют роль в развитии метаболических нарушений (ожирение и диабет II типа), аутоиммунных расстройств (рассеянный склероз (РС) и диабет I типа) и воспалительных процессов. заболевание кишечника (ВЗК) (28–31).

APC, особенно DC и макрофаги, используют PRR для поддержания гомеостаза кишечника (обсуждается в разделе «Иммунитет и бактериальные патогены»).Макрофаги играют важную роль в поддержании толерантности к комменсальной микробиоте и пищевым антигенам. Хотя макрофаги проявляют сильную бактерицидную активность, они не являются ключевым источником основных воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-23 (32, 33). Однако макрофаги конститутивно продуцируют IL-10 и отвечают на него. Произведенный из макрофагов IL-10 критически важен для развития, поддержания и размножения клеток Foxp3 + T reg (34–36). DC также поддерживают толерогенные ответы, взаимодействуя с адаптивными иммунными клетками.ДК представляют люминальные антигены во вторичных лимфоидных органах кишечника. К ним относятся пейеровы бляшки (PP) и брыжеечные лимфатические узлы (MLN). DC регулируют перемещение лимфоцитов в кишечник, индуцируя экспрессию рецепторов кишечника (CCR9 и α4β7) (37, 38). DC также являются основным источником IL-23, который в сочетании с другими цитокинами влияет на дифференцировку клеток T h 17 и способствует образованию IL-22, тканезащитного цитокина. Дефекты в NOD2 и генах, связанных с аутофагией ( ATG16L и IRGM ) в ДК пациентов с ВЗК, выявляют нарушение презентации антигена, высвобождение цитокинов и усиление воспаления (39–41).

ВЗК характеризуется хроническим воспалением желудочно-кишечного тракта из-за начала таких заболеваний, как язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК). Повышенная экспрессия T h 1-производного IFN-γ и T h 17 ассоциированных IL-17A и IL-22 очевидна в воспаленной ткани пациента с CD (42, 43). Полногеномные исследования ассоциации показывают, что гены ( IL23R и STAT3 ), кодирующие пути дифференцировки T h 17, связаны с повышенным риском ВЗК.Это предполагает терапевтическое значение нацеливания на IL-23 или IL-17A при ВЗК (44, 45). Действительно, было показано, что нейтрализация IL-23 эффективна для уменьшения воспаления кишечника. Устекинумаб, антитело, направленное против субъединицы IL-12p40, используется для блокирования как IL-12, так и IL-23 и одобрено FDA для лечения умеренной и тяжелой БК, тогда как антитело, нацеленное на субъединицу IL-23p19 (IL-23) в настоящее время проходит клинические испытания как для CD, так и для UC (46, 47). Интересно отметить, что клиническое испытание, в котором моноклональные антитела против IL-17A использовались для лечения CD, было преждевременно прекращено, поскольку лечение этими антителами было связано с пагубными эффектами (48).Впоследствии мы и другие показали, что IL-17A имеет решающее значение для сохранения эпителиального барьера и регулирования колонизации кишечной микробиоты (30, 49, 50). Кроме того, было показано, что IL-23 не требуется для генерации IL-17A из γδ Т-клеток во время химически индуцированного колита (49). Это может объяснить, почему нейтрализация анти-IL-23 и IL-17A приводит к противоречивым результатам. Остается неясным, что регулирует генерацию IL-17A в γδ Т-клетках. Возможно, что происходящий из DC IL-6 или другие факторы регулируют ответы IL-17A в кишечнике, поскольку было показано, что CD103 + CD11b + DC регулируют дифференцировку T h 17 зависимым от IL-16 образом ( 51).

Было показано, что кишечная микробиота и микробные метаболиты регулируют ответы IL-17A в кишечнике. Было показано, что кишечная микробиота, особенно сегментированные нитчатые бактерии (SFB), индуцирует T h 17 ответов (52–54). Индукция ответов клеток Т h 17 с помощью SFB хорошо охарактеризована. Макрофаги, происходящие из моноцитов, регулируют индукцию SFB антиген-специфических клеток T h 17 (55, 56). Кроме того, колонизация SFB связана с повышенной экспрессией IL-21 и изоформ сывороточного амилоида A (SAA).SAA косвенно способствует дифференцировке клеток T h 17, воздействуя на DC (53, 57). Было показано, что наряду с SFB смесь из двадцати бактериальных изолятов, включая видов Clostridium и Bifidobacterium от пациента с язвенным колитом, индуцирует активность T h 17 (57). Кроме того, было показано, что Escherichia coli Schaedler и Morganella Morganii регулируют дифференцировку клеток T h 1 и T h 17 через полученные из моноцитов ДК (58).Более того, CD172α + lamina propria DCs способствуют микробной антиген-специфической дифференцировке клеток T h 17 в ответ на активацию TLR5 (59). Микробиота, включая SFB, индуцирует Т ч 17 ответов; однако плохо известно, как иммунные клетки регулируют функции кишечной микробиоты, такие как колонизация SFB. Мы и другие показали, что IL-17A и IL-22 регулируют микробиоту кишечника, включая колонизацию SFB (30, 60, 61). Кроме того, мы показываем, что кишечная регуляция микробиоты кишечника с помощью IL-17A модулирует системный аутоиммунитет, предполагая взаимосвязь инь-ян между микробиотой кишечника и клеточными ответами T h 17 (30).

Дифференциация наивных Т-клеток в патогенные (α / β CD4 + Т-клетки, которые экспрессируют высокие уровни IL-23R, совместно продуцируют IL-17A и IFN-γ / GM-CSF и вызывают аутоиммунитет) или непатогенные (α / β CD4 + Т-клетки, которые продуцируют IL-17A и IL-17F, но не индуцируют аутоиммунитет) T h 17 клеток находится под влиянием цитокинов, производных от DC. Наивные Т-клетки, подвергшиеся воздействию TGF-β1 и IL-6, дифференцируются в непатогенные T h 17 клетки, но те, которые подвергались воздействию TGF-β1, IL-6 и IL-23 или TGF-β3 и IL-6, развиваются в патогенный T h 17 клеток (62).Передача сигналов с помощью IL-23 увеличивает экспрессию T-bet и продукцию TGF-β3 за счет развития клеток T h 17. Точно так же передача сигналов IL-23 была связана с повышенной экспрессией RORγt и продукцией GM-CSF, необходимого цитокина для прогрессирования аутоиммунитета, клетками T h 17 (63). Производство метаболитов жирных кислот, получаемых с пищей, также влияет на дифференцировку Т-клеток (64). Например, стимуляция длинноцепочечными жирными кислотами запускает дифференцировку наивных Т-клеток в клетки Т h 1 и Т h 17 посредством активации p38-MAPK.Это, в свою очередь, способствует возникновению аутоиммунитета (64).

В то время как SFB в основном были связаны с дифференцировкой клеток T h 17, было показано, что видов Bacteroides fragilis или Clostridia регулируют индукцию и активность клеток T reg (65, 66). Полисахарид A, полученный из B. fragilis , активирует DCs TLR2-зависимым образом, чтобы индуцировать дифференцировку клеток T reg и генерацию IL-10 (66, 67). Смесь семнадцати видов Clostridia, которые индуцируют дифференцировку и функцию клеток T reg , были выделены из образца фекалий человека (65).Когда стерилизованных мышей инокулировали смесью, наблюдали увеличение численности и индукции клеток T reg . Эти изменения могут быть связаны с увеличением производства зависимых от микробиоты метаболитов жирных кислот, особенно SCFAs. Это исследование показывает, что SCFAs стимулируют секрецию TGF-β эпителиальными клетками, способствуя индукции клеток T reg (65). Kashiwagi et al. Показали, что TGF-β, полученный из DC через пути TLR2-Smad3, важен для генерации клеток T reg в собственной пластинке мышей, которым была инокулирована Clostridium butyricum (68).Впоследствии важность SCFAs, особенно бутирата, в регуляции дифференцировки T reg была показана во многих исследованиях (69, 70). Было показано, что бутират и пропионат непосредственно модулируют генерацию T reg , способствуя ацетилированию гистона h4 локуса и белка Foxp3 (69, 70). Кроме того, было показано, что передача сигналов бутирата в макрофагах и DC через GPR109a, рецептор бутирата и ниацина, способствует развитию клеток T reg (71). У мышей с дефицитом GPR109a меньше Т-лимфоцитов CD4, продуцирующих IL-10 (71).Клетки T reg толстой кишки экспрессируют TCR, включая CT7, которые, скорее всего, помогают распознавать специфические антигены, происходящие из комменсальной микробиоты (72). Эти TCR являются уникальными для клеток T reg толстой кишки, поскольку они не экспрессируются клетками T reg вне толстой кишки (72).

APC также модулируют комменсальную микробиоту-зависимую реакцию клеток T h 2. Мыши, получавшие пропионат, демонстрируют повышенную продукцию макрофагов и предшественников DC в костном мозге.Однако эти ДК нарушены в индукции эффекторных функций клеток Т h 2 в модели аллергического воспаления, зависимого от экстракта клеща домашней пыли (73).

Наряду с клетками T h 17 и T reg , врожденные лимфоидные клетки (ILC) поддерживают иммунитет, взаимодействуя с APC, чтобы влиять на комменсальные бактерии и эффекторные функции T-клеток. ILC разделены на три группы (ILC1, ILC2 и ILC3) на основании частично секретируемых ими цитокинов. Подобно клеткам T h 17, клетки ILC3 секретируют IL-17A и IL-22 (рисунок 1) (74).IL-22, секретируемый ILC3, может действовать на эпителиальные клетки, индуцируя экспрессию антимикробных пептидов. Было показано, что IL-23, полученный из CD103 + CD11b + DC, регулирует врожденные ответы IL-22 после введения бактериального флагеллина (75). ILC3 также напрямую взаимодействуют с Т-клетками. Рецепторы MHC II экспрессируются ILC CCR6 + RORγt + , что обеспечивает прямое связывание и презентацию антигенов с CD4 + Т-клетками (76). При взаимодействии с Т-клетками ИЛК кишечника поддерживают гомеостаз, ограничивая иммунные ответы против комменсальных бактерий (76).Было показано, что TNF-подобный лиганд 1 (TL1A), происходящий из мононуклеарных фагоцитов, регулирует ILC3-зависимую регуляцию продукции IL-22 и защиту слизистой оболочки хозяина во время острого колита (77). TL1A также регулирует экспрессию костимулирующей молекулы OX40L в MHC II + ILC3. Это необходимо для антиген-специфических Т-клеточных ответов на модели хронического колита (77).

Рисунок 1 . Обзор взаимодействий врожденного иммунитета при гомеостазе и дисбактериозе. У здоровых людей комменсальная микробиота выделяет продукты, включая SCFA, такие как бутират, которые действуют на DC, поддерживая толерантную к комменсалу иммунную систему.Присутствие комменсальных микробов также было связано с повышенным присутствием клеток T h 17. Кроме того, ILC секретируют цитокины для изменения функции Т-клеток для поддержания гомеостаза. Когда дисбактериоз вызван бактериальными патогенами, такими как S . Typhimurium, изменяется состав микробиоты и увеличивается секреция слизи. С . Инфекция Typhimurium происходит посредством трансцитоза М-клетками в пейеровы бляшки, где бактерия может перемещаться по лимфатическим сосудам к MLN.Для создания иммунного ответа: S . Антигены Typhimurium, такие как мономеры флагеллина, обнаруживаются TLR5 DC. Затем DC продуцируют IL-23, который способствует высвобождению IL-17 Т-клетками памяти. IL-17 стимулирует дифференцировку наивных CD4 + Т-клеток в Т h 17 клеток. Точно так же рецепторы TLR9 и NOD2 активируются в клетках Панета для усиления секреции AMP.

Иммунитет и бактериальные патогены

В то время как комменсальные бактерии прямо или косвенно (через APC) влияют на дифференцировку Т-клеток, APC используют TLR для распознавания специфических микробных маркеров, изменяя функцию Т-клеток для борьбы с бактериальными патогенами.TLR клеточной поверхности способствуют фагоцитозу микробных патогенов DC и макрофагами. Связывание поверхностных TLR со специфическими микробными PAMP или целыми бактериями, такими как E. coli или Staphylococcus aureus , вызывает фагоцитоз рецепторов (78). Активация различных APC TLR приводит к продукции цитокинов, которые способствуют дифференцировке наивных Т-клеток в Т h 1 клетки. Об этом свидетельствует активация двух TLR, TLR2 и TLR4, которые экспрессируются в иммунных клетках и эпителиальных клетках кишечника (79).TLR2 связывается с грамположительными и грамотрицательными бактериальными компонентами, включая липотейхоевую кислоту, порины и пептидогликан, но TLR4 связывается только с липополисахаридом, компонентом, специфичным для грамотрицательной внешней мембраны (79–81). При активации TLR4 способствует выработке IL-12 p70, активной формы IL-12, которая состоит из субъединиц p35 и p40. IL-12 p70 помогает в поляризации наивных Т-клеток в Т h 1 клеток (81). С другой стороны, активация TLR2 приводит к увеличению продукции гомодимера IL-12 p40, который действует как антагонист рецептора IL-12 (81).

Третьим TLR, экспрессируемым иммунными клетками и эпителием кишечника, является TLR5, рецептор, который специфически связывается с мономерами флагеллина грамположительных и грамотрицательных бактерий (79). Жгутики - это длинные шиповидные структуры, используемые бактериями для подвижности, адгезии и секреции факторов вирулентности. Многочисленные кишечные патогены, включая Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium и Campylobacter jejuni , продуцируют жгутики для успешной колонизации и инвазии хозяина (82–84).Передача сигналов TLR5 в DCs приводит к активации оси IL-22/23 (85). Затем IL-23 стимулирует секрецию IL-17A Т-клетками памяти и способствует дифференцировке наивных CD4 + Т-клеток в T h 17 клетки (рис. 1) (86–88). Активация TLR5, экспрессируемого эпителиальными клетками и DC, играет важную роль в уничтожении патогенных бактерий, таких как адгезивные инвазивные E. coli . Передача сигналов эпителиального TLR5 важна для ограничения прикрепления бактерий в кишечнике (85).

TLR также могут взаимодействовать с другими рецепторами врожденного иммунитета и влиять на них, чтобы влиять на функцию Т-клеток. Это отображается во взаимодействиях между TLR и NOD2. NOD2 является частью семейства NLR, кодируется геном Card15 и распознает грамположительные и грамотрицательные пептидные пептиды, включая мурамилдипептид (MDP) (89, 90). Активация NOD2 связана с измененной передачей сигналов TLR2. Как указывалось ранее, TLR2 активируется в ответ на пептидогликан.Активация как NOD2, так и TLR2 приводит к передаче сигналов NF-κB. Когда передача сигналов NOD2 стимулируется MDP, индуцированная TLR2 передача сигналов NF-κB и продукция IL-12 ингибируются. Однако в APC Card15 - / - передача сигналов NOD2 не происходит, но передача сигналов TLR2 все еще может происходить; при лечении пептидогликаном эти мыши демонстрируют более высокую продукцию IL-12 макрофагами из-за усиления передачи сигналов NF-κB. Это усиливает ответы Th2 (производство IL-12, IFN-γ и IL-18) (91). Помимо того, что они экспрессируются APC, TLR9 и NOD2 уникальны, потому что оба они экспрессируются клетками Панета, подмножеством эпителиальных клеток, продуцирующих антимикробные пептиды, в криптах тонкого кишечника.Хотя многие антимикробные пептиды экспрессируются конститутивно, передача сигналов бактериальными антигенами, включая флагеллин, пептидогликан и липополисахарид, может дополнительно стимулировать их производство (92).

Кишечные патогены используют факторы вирулентности, чтобы избежать обнаружения и изменить реакцию врожденной иммунной системы. Двумя такими патогенами являются Salmonella enterica серовар Typhi и Salmonella enterica серовар Typhimurium . В то время как S. Typhi и S.Typhimurium - это тесно связанные кишечные патогены, они вызывают различные болезненные состояния у людей. S. Typhi вызывает брюшной тиф через кишечник и затем распространяется на системные органы; с другой стороны, инфекция S. Typhimurium ограничивается кишечником и обычно вызывает энтерит (93). Инфекция S. Typhi специфична для людей и не встречается у мышей (94). Это может быть связано со способностью мышей, но не людей, продуцировать TLR11, который активируется флагеллином 94.В отличие от S. Typhi, S. Typhimurium может инфицировать несколько хозяев, включая мышей. Поэтому S. Typhimurium используется для изучения тифоподобного распространения у восприимчивых линий мышей (94, 95). Адаптивные В- и Т-клеточные ответы необходимы для обеспечения защиты в мышиной модели инфекции Salmonella. У инфицированных мышей S. Typhimurium проникает в эпителиальные клетки подвздошной кишки, включая клетки микроскладок (М). М-клетки представляют собой специализированные эпителиальные клетки, которые помогают трансцитозу просветных антигенов и микробов в РР, область вторичной лимфоидной ткани, которая содержит ДК, Т-клетки и В-клетки (96).После обнаружения бактерий бокаловидные эпителиальные клетки активируют выработку слизи, в частности муцина 2, чтобы ограничить контакт S. Typhimurium с эпителиальным слоем (97). Чтобы обойти это, S. Typhimurium экспрессирует жгутики и систему секреции типа III (T3SS), которая кодируется Salmonella Pathogenicity Island 1 (SPI-1) (84, 93). Эффекторные белки вводятся через SPI-1 T3SS в эпителиальные клетки, чтобы изменить их форму цитоскелета и целостность плотных контактов. В то время как введение эффекторов в М-клетки способствует оптимальной бактериальной инвазии, мутанты SPI-1 S.Typhimurium все еще может проникать в М-клетки, но в меньшей степени (рис. 1) (93). Попав внутрь PP, S. Typhimurium может инфицировать DC, которые будут транспортироваться CCR7-зависимым образом в MLN (98). Затем S. Typhimurium распространяется на системные ткани, включая печень и селезенку, и реплицируется в фагоцитах, таких как макрофаги (93). Чтобы избежать деградации в макрофагах, S. Typhimurium экспрессирует второй T3SS, кодируемый Salmonella Pathogenicity Island 2 (99). ДК, инфицированные S. Typhimurium display, ингибируют презентацию антигена, что предотвращает стимуляцию наивных Т-клеток (100).S. Typhimurium также может напрямую инфицировать Т-клетки, подавляя их пролиферацию и секрецию цитокинов, включая IL-2 и IFN-γ (100).

Другой хорошо изученный кишечный патоген, L. monocytogenes , изменяет функцию APC, влияя на функцию Т-клеток. Подобно S. Typhimurium, L. monocytogenes реплицируется в макрофагах. Инфицированные макрофаги высвобождают TNF-α и IL-12, которые способствуют секреции IFN-γ из NK-клеток (101). Затем секретируемый IFN-γ активирует макрофаги для производства реактивного кислорода и промежуточного азота для предотвращения утечки L.monocytogenes из фагосом и способствует бактериальной деградации (102). Чтобы способствовать его росту, L. monocytogenes индуцирует продукцию интерферонов типа I (IFN). Ускользание L. monocytogenes из фагосом макрофагов (которое происходит из-за продукции листериолизина O, порообразующего токсина) приводит к усилению регуляции IFN-α и IFN-β инфицированным макрофагом (103, 104). Повышенная продукция IFN типа I была связана с повышенным апоптозом Т-клеток и большей выработкой IL-10, что способствует размножению бактерий (104).

Т-клетки памяти также помогают бороться с инфекцией, вызываемой L. monocytogenes , и составляют основной компонент Т-клеток кишечника, включая тканевую эффекторную память (ТЕМ), центральную память (ТКМ) и резидентные клетки памяти (TRM). В то время как TEM и TCM клетки находятся в крови и селезенке, TCM может находиться в лимфоидных тканях, а TEM может находиться в нелимфоидной ткани (105). Клетки TRM преимущественно находятся в собственной пластинке кишечника и в интраэпителиальных лимфоцитах кишечника и обеспечивают иммунную регуляцию на протяжении всей жизни (106).При оральном заражении L. monocytogenes CD103 + DC приобретают и обрабатывают бактериальные антигены. Эти DC экспрессируют CCR7 и перемещаются от LP через лимфатические сосуды к MLN (107, 108). В MLN DC представляют антигенов L. monocytogenes наивным CD8 Т-клеткам. Активированные Т-клетки пролиферируют и дифференцируются в ранние эффекторные клетки, которые в дальнейшем дифференцируются либо в короткоживущие эффекторные клетки, либо в эффекторные клетки-предшественники памяти (108). Эффекторные клетки-предшественники памяти могут дифференцироваться в TEM или TCM и мигрировать в кишечник (108).DC выделяют ретиноевую кислоту, которая связывается с рецептором ретиноевой кислоты Т-клеток. После связывания с RA Т-клетки демонстрируют повышенную экспрессию интегрина α4β7 и CCR9, оба из которых направляют миграцию в LP тонкой кишки (105, 109). Оказавшись в месте инфицирования, ТЕМ-клетки экспрессируют гранзим В. Однако экспрессия гранзима В подавляется в клетках ТСМ (105).

Энтеропатогенный E. coli (EPEC) и энтерогеморрагический E. coli (EHEC) - два клинически значимых возбудителя кишечных патогенов человека, вызывающих смерть от тяжелой диареи. Citrobacter rodentium ( C. rodentium ) - мышиный патоген, который разделяет несколько клинических патологических механизмов EPEC и EHEC и, следовательно, служит полезной моделью для понимания врожденных и адаптивных иммунных ответов в кишечнике после инфекции, а также патогенез ВЗК (110, 111). Прикрепление и стирание (A / E) поражения, образованное EPEC, EHEC и C. rodentium , отличает их от других кишечных патогенов и комменсальной E. coli. Поражения A / E образуются, когда патогенная бактерия связывается с эпителием кишечника, модифицирует щеточную кайму и вводит эффекторные белки в клетку-хозяин через T3SS.Эти эффекторы затем влияют на активность факторов нуклеации актина хозяина, N-WASP и Arp2 / 3, чтобы способствовать полимеризации актина. Это приводит к образованию актинового пьедестала, который поднимает бактерию над соседними эпителиальными клетками, чтобы еще больше способствовать ее патогенезу (112). Для борьбы с инфекцией C. rodentium необходимы как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ, поскольку мыши, дефицитные по Rag1, погибают от инфекции (113). Инфекция C. rodentium приводит к дисбактериозу микробиоты и развитию колита (114, 115).Интересно, что дисбиоз микробиоты является ключевым фактором, влияющим на восприимчивость к инфекции C. rodentium и иммунные ответы (115, 116). Myd88-зависимая передача сигналов TLR2 и TLR4 стимулируется в эпителиальных и миелоидных клетках для распознавания бактериальных PAMP. DC и макрофаги секретируют провоспалительные цитокины, включая IL-12, IL-6, IL-23 и TNF-α, в ответ на активацию PRR. IL-22, происходящий из Th27, Th32 и ILC3, играет важную роль в регуляции инфекции C. rodentium (117, 118).IL-23 необходим для обеспечения защиты от инфекции C. rodentium зависимым от IL-22 образом117. Было высказано предположение, что IL-22-зависимая индукция антимикробного пептида Reg3γ регулирует инфекцию C. rodentium . Однако недавнее исследование показывает, что мыши Reg3γ - / - одинаково восприимчивы к инфекции. Возможно, что другой член семейства Reg3 антимикробного пептида компенсировал Reg3γ. Остается неясным, как IL-22 регулирует инфекцию C. rodentium .Поскольку IL-22Ra1 экспрессируется на абсорбирующих клетках (энтероцитах), секреторных клетках (кубок, Панет) и стволовых клетках кишечника, будущая работа должна быть направлена ​​на понимание эффектов IL-22 на множественные клоны кишечных клеток (119).

видов Yersinia являются грамотрицательными бактериями, среди которых Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica являются патогенными для человека. Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica вызывают иерсиниоз, который приводит к гастроэнтериту и мезентериальному лимфадениту и может быть смертельным при распространении в печень и селезенку.Подобно сальмонелле и другим патогенам, Yersinia использует T3SS для введения токсина (внешний белок Yersinia, Yops) в цитоплазму клетки. Эти Yops (YopE, YopJ, YopH, YopM, YopO и YopT) нарушают внутриклеточную передачу сигналов в макрофагах, что приводит к ингибированию секреции и фагоцитоза цитокинов (IL-1β, IL-18, необходимых для набора клеток врожденного иммунитета). Несколько исследований показывают, что YopE содержат доминантный эпитоп Т-лимфоцитов CD8, который необходим для обеспечения защиты (120–124). Кроме того, для защиты от последующей инфекции также требуется ответ Т-лимфоцитов CD8.Макрофаги CXCR1 + и / или DC-зависимая презентация антигена и местные воспалительные состояния имеют решающее значение для развития гетерогенной популяции (CD103 + или CD103–) клеток CD8 TRM в кишечнике (125).

Иммунитет в ответ на рак

Колоректальный рак (CRC) неизменно является причиной многих связанных с раком смертей среди мужчин и женщин. Это третий по распространенности рак у мужчин и женщин и четвертый по значимости причиной смерти от рака. Несмотря на то, что глобальные показатели заболеваемости и смертности от КРР сильно различаются, страны с быстрым переходом (на которые указывает средний или высокий индекс человеческого развития), как правило, демонстрируют повышенную заболеваемость и смертность от КРР (122).За последние несколько лет заболеваемость CRC снижалась у лиц старше 50 лет, но растет у молодых людей (126). Возникновение колоректального рака связано с различными факторами, включая генетику, кишечную микробиоту и иммунную активность (127–129). В частности, было показано, что высвобождение цитокинов с помощью APC влияет на развитие раковых клеток (87, 130, 131).

Клетки

CRC экспрессируют опухоль-ассоциированные антигены (TAA) и опухолеспецифические антигены (TSA).Хотя TSA уникальны для опухолей, TAA могут присутствовать в нормальных клетках и опухолевых клетках. Общие TAA и TSA включают карциноэмбриональные антигены (CEA), ген опухоли Вильма 1 (WT1), Muc1, Her2 и p53 (132–134). DC могут захватывать тельца убитых опухолевых клеток, обрабатывать TAA и представлять эти антигены через молекулы MHC I или MHC II, соответственно, TCR CD4 + T-клеток или CD8 + T-клеток (135). Активация APC в ответ на рак также может происходить посредством связывания PRR, экспрессируемых APC, с DAMP, полученными из опухоли.DAMPs могут высвобождаться опухолевыми клетками в ответ на противоопухолевую терапию или стрессовые пути. Что касается CRC, три основных DAMP, которые стимулируют противоопухолевые реакции DC, включают High Mobility Group Box 1 (HMGB1), внеклеточный АТФ и кальретикулин (CRT). Хотя обычно он ограничен ядром и цитоплазмой, HMGB1 секретируется некротическими опухолевыми клетками. Высвобожденный HMGB1 может связываться с DC-экспрессируемым TLR4 для усиления презентации антигена (136, 137). HMGB1 также может передавать сигнал через экспрессируемый DC мембранный белок RAGE, способствуя передаче сигналов NF-κB и созреванию DC (138).АТФ, высвобождающийся из умирающих опухолевых клеток, может связываться с рецептором P2XY DC. Это связывание способствует привлечению DC к строме опухоли. CRT обычно экспрессируется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) онкогенных клеток. Химиотерапевтические агенты вызывают высвобождение активных форм кислорода и вызывают стресс ER. Это способствует транспорту CRT из ER на поверхность клетки, где CRT служит сигналом для DC-опосредованного поглощения, деградации и презентации антигена цитотоксическим CD8 + T-клеткам (139).В то время как DC жизненно важны для противоопухолевого иммунного ответа, раковые клетки используют различные механизмы, чтобы избежать иммунного обнаружения. Раковые клетки могут подавлять регуляцию TAA, модулировать процессы процессинга или презентации антигена, высвобождать цитокины, которые способствуют функции T reg , секретируют иммуносупрессивные факторы и экспрессируют лиганды, которые блокируют иммунные контрольные точки (140). Кроме того, было показано, что иммуносупрессивные клетки в микроокружении опухоли, такие как опухолевые макрофаги (ТАМ), ассоциированные с раком фибробласты и клетки T reg , подавляют противоопухолевый иммунитет (140).

Для повышения иммунитета против опухолей DC и активированные Т-клетки секретируют несколько цитокинов. Двумя важными противоопухолевыми цитокинами являются ИЛ-2 и ИЛ-15. Эти цитокины могут вызывать сходные биологические эффекты, и рецепторы этих цитокинов имеют сходные структурные особенности, включая общую γ-цепь и цепь IL-2 / IL-15Rβ (141, 142). Связывание IL-2 или IL-15 с их рецептором приводит к активации киназ Janus (JAK). JAK1 активируется, когда IL-2 или IL-15 связываются с β-цепью рецептора, но JAK3 активируется, когда IL-2 или IL-15 связываются с или γ-цепью рецептора (141).JAK связываются со своим соответствующим лигандом, способствуя димеризации рецептора. Димеризованные JAK фосфорилируют друг друга, а фосфорилированные JAK фосфорилируют консервативный тирозиновый остаток сигнальных преобразователей и активаторов молекул транскрипции (STAT), которые затем проникают в ядро ​​для регуляции транскрипции (141, 143). Хотя IL-2 секретируется в основном стимулированными CD4 + T-клетками, он также продуцируется эффекторными CD8 + T-клетками, DC и NK-клетками (141, 144–148). Передача сигналов IL-2 может влиять на функции CD4 + T-клеток, CD8 + T-клеток и NK-клеток (141, 149–152).IL-15 экспрессируется на поверхности ряда типов клеток, включая моноциты, макрофаги и DC, и влияет на активацию DC, пролиферацию CD8 + T-клеток и развитие NK-клеток (142, 153–155). IL-2 и IL-15 могут играть роль в предотвращении колоректального рака и были изучены как потенциальные иммунотерапевтические агенты (141, 148, 156). Однако лечение этими цитокинами, возможно, придется дополнить. Например, выживаемость пациентов с меланомой, получавших ИЛ-2 и вакцину против меланомы, показала более высокую выживаемость по сравнению с пациентами, которых лечили только ИЛ-2 (157).Исследования также изменили структуру IL-2, чтобы повысить его эффективность в качестве иммунотерапевтического агента (158). «Суперкины» IL-2 обладают повышенным сродством к IL-2Rβ и демонстрируют повышенную активацию NK- и CD8 + Т-клеток. Мыши, которым вводили клетки меланомы, карциномы толстой кишки или карциномы легких, а затем лечили модифицированным ИЛ-2, демонстрировали пониженный онкогенез по сравнению с мышами, получавшими немодифицированный ИЛ-2 (158). Возникновение колоректального рака обычно изучали путем введения азоксиметана (AOM) в сочетании с декстрансульфатом натрия (DSS) для индукции колит-ассоциированной карциномы у мышей.По сравнению с мышами дикого типа, получавшими AOM / DSS, мыши Il15 - / - , получавшие AOM / DSS, проявляли повышенный онкогенез и снижение выживаемости159. Мыши CD11c-Il15 демонстрируют восстановленную продукцию IL-15 в APC. В отличие от мышей Il15 - / - , у которых наблюдаются пониженные уровни NK и CD8 + Т-клеток, у мышей CD11c-Il15 обнаруживаются аналогичные уровни NK и CD8 + Т-клеток, как у мышей дикого типа. Мыши CD11c-Il15 также демонстрируют сниженный AOM / DSS-индуцированный туморогенез (159). Хотя было показано, что IL-2 и IL-15 уменьшают возникновение рака, другие исследования показали, что они могут иметь незначительный терапевтический эффект или даже способствовать онкогенезу (141, 148).Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для выяснения взаимосвязи между этими цитокинами и возникновением рака.

Присутствие различных классов Т-клеток в микроокружении опухоли было связано с изменением тяжести прогноза. Высокие уровни клеток T h 17 и экспрессия генов T h 17 (включая IL17A и Rorc ) связаны с плохим прогнозом для CRC, но пациенты с высокой экспрессией T h 1 цитотоксических генов (включая Ccl5, Stat1 и Il27 ) улучшили частоту безрецидивной выживаемости (160, 161).Помимо того, что он секретируется Т-клетками, ИЛ-27 секретируется ДК и макрофагами в ответ на бактериальный и паразитарный патогенез, подавляя T h 1, T h 2 и T h 17 развитие клеток и воспалительные реакции ( 130, 162). Специфический для энтероцитов нокдаун IL-17RA, общего рецептора для IL-17A, IL-17F и IL-17C, приводил к уменьшению образования опухолей, тем самым указывая на прямую роль IL-17A или других цитокинов членов семейства IL-17 в онкогенезе. (163). Повышенная регуляция IL-17A в опухолях толстой кишки зависит от активации передачи сигналов IL-23 клетками CD11b + (164).Это увеличение IL-23 за счет DC и последующее увеличение IL-17A может быть связано с: (1) микробиотой и (2) нарушением эпителиального барьера. По сравнению с микробиотой здоровых людей, пациенты с CRC обладают измененной микробиотой, которую можно отличить по присутствию бактерий, таких как Fusobacterium nucleatum , которые способствуют пролиферации клеток CRC (165). Повышенный уровень IL-23 может быть вызван усилением передачи сигналов TLR / MyD88, индуцированной кишечной микробиотой, поскольку мышей с нокаутом у Myd88 - / - и мышей тройного нокаута у Tlr2,4,9 - / - демонстрируют уменьшенную опухоль рост.Точно так же мыши, получавшие антибиотики для индукции истощения комменсальной микробиоты, демонстрировали уменьшение размера опухоли и экспрессию IL-23 и IL-17A (164). Также было показано, что клетки CRC являются «неплотными», поскольку они экспрессируют дефектные барьерные белки, включая муцин 2 и соединительные молекулы адгезии -A и -B (164). Это потенциально позволяет увеличить проникновение микробов и микробных продуктов в раковые клетки, чтобы стимулировать передачу сигналов TLR и, в свою очередь, экспрессию IL-23 с помощью DC, которые затем активируют клетки T h 17 с высвобождением IL-17A (164).Экспрессия IL-17 также была связана с онкогенными процессами, включая активацию проангиогенных факторов и неоваскуляризацию (рис. 2) (166, 167).

Рисунок 2 . CRC-измененная микробиота-зависимая передача сигналов врожденного иммунитета способствует онкогенезу. Микробиота кишечника изменяется с прогрессированием CRC. Например, повышенные уровни F. nucleatum были связаны с повышенной тяжестью CRC. Клетки CRC также обладают «протекающим» эпителиальным слоем, который позволяет микробным продуктам проникать в микроокружение опухоли.Эти продукты активируют сигнализацию TLR с помощью контроллеров домена. Затем IL-23 секретируется DC, чтобы способствовать секреции IL-17A клетками T h 17. IL-17A, в свою очередь, связан с ангиогенезом.

IL-6 - еще один провоспалительный цитокин. Связывание IL-6 с киназой Janus способствует активации STAT3 (168). Затем STAT3 входит в ядро ​​для увеличения транскрипции антиапоптотических генов, включая Bcl2 и Mcl1 , и метастатических генов, включая Mmp1 и Mmp2 (169–171).Повышенные уровни IL-6 были связаны с различными видами рака, включая рак легких, печени, поджелудочной железы и толстой кишки (172). Точно так же передача сигналов IL-6 и последующая активация STAT3 были связаны с транслокацией hMSh4, белка репарации ошибочного спаривания ДНК, из ядра в цитозоль (173). Эта транслокация позволяет накапливать тетрануклеотидные мутации сдвига рамки считывания, чтобы способствовать CRC (173). Некоторые иммунные клетки, продуцирующие IL-6, представляют собой DC, макрофаги и клетки T h 17 (87, 131, 174).Было показано, что IL-23 индуцирует продукцию IL-6 клетками T h 17 (87, 175). В свою очередь, IL-6 помогает в дифференцировке клеток T h 17, способствуя экспрессии IL-21, который индуцирует продукцию IL-17A посредством активации факторов транскрипции STAT3 и RORγt (176). Активация IL-6 также способствует онкогенезу, изменяя экспрессию генов для индукции пролиферации клеток, прогрессирования эпителиального перехода в мезенхимальный и устойчивости к противораковым препаратам, таким как эрлотиниб (168).Передача сигналов с помощью IL-11, члена семейства цитокинов IL-6, также способствует развитию CRC путем активации STAT3 (177). IL-11 был идентифицирован как более доминирующий активатор передачи сигналов STAT3 и индуктор CRC, чем IL-6. Точно так же ингибирование передачи сигналов IL-11 было связано с уменьшением роста опухоли и уменьшением тяжести опухоли. Однако, в то время как кроветворные клетки продуцируют IL-11, секреция IL-11 негематопоэтическими клетками в большей степени ответственна за прогрессирование CRC (177). Наряду с IL-6 и IL-11 повышенные уровни IL-22 были связаны с раком толстой кишки.Было показано, что IL-22 активирует передачу сигналов STAT3 и дополнительно усиливает развитие рака толстой кишки (178, 179). У мышей с нокаутом IL-22-связывающего белка, растворимого рецептора для IL-22, наблюдается зависимый от IL-22 рост опухоли (180). Было показано, что ILC3 являются основным источником IL-22 у мышей, способствующего онкогенезу; однако исследования на людях показывают, что клетки CCR6 + T h 17 являются основными продуцентами IL-22 (179, 181). В настоящее время ингибиторы IL-6 и STAT3 исследуются как потенциальные терапевтические агенты для подавления роста опухоли (182).

Помимо STAT3, TNF-α является критическим цитокином из-за его роли в регуляции сигнальных путей и воспалительных реакций, особенно в отношении про- и противоопухолевой активности. Как и другие цитокины, TNF-α продуцируется рядом типов клеток, включая эпителиальные клетки, макрофаги, нейтрофилы, NK-клетки и Т-клетки (183–186). Повышенные уровни TNF-α были связаны с повышенными уровнями инфильтрации незрелых миелоидных клеток, которые развиваются в опухолегенные клетки, такие как опухолевые макрофаги и нейтрофилы (TAM и TAN), когда они подвергаются воздействию микроокружения опухоли (187, 188).Было показано, что в некоторых типах клеток стимуляция TNF-α стимулирует рекрутирование моноцитов в опухоли, стимулируя экспрессию хемоаттрактантного белка-1 моноцитов (CCL2) (189, 190). Различные типы клеток продуцируют CCL2, включая гладкомышечные и мезенхимальные стромальные клетки, а также другие моноциты и макрофаги (191–193). ТАМ продуцируют цитокины, такие как ИЛ-10, которые ингибируют функцию Т-клеток. Было показано, что IL-10 увеличивает экспрессию Mgat5, гликозилтрансферазы, которая увеличивает разветвление гликопротеинов на поверхности CD8 + Т-клеток и ассоциируется с прогрессированием рака (194, 195).Повышенное разветвление гликопротеинов препятствует прямым взаимодействиям Т-клеток с APC и снижает передачу сигналов TCR, что способствует плохой чувствительности к антигенам (194). Хотя повышенная экспрессия ИЛ-10, продуцируемого ТАМ, коррелирует с прогрессированием некоторых видов рака, включая немелкоклеточную карциному легких, роль ИЛ-10 в стимулировании CRC до конца не изучена, поскольку он выполняет как защитную, так и воспалительную роль (196). –198).

Программируемая смерть 1 (PD-1) экспрессируется на поверхности Т-клеток и взаимодействует с PD-L1, лигандом, в основном экспрессируемым макрофагами, активированными DC и раковыми клетками (199).Аналогичным образом, цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (CTLA4) экспрессируется на наивных Т-клетках или Т-клетках памяти и взаимодействует с CD80 / CD86 на поверхности ДК. Хотя в этом обзоре не будут подробно рассмотрены взаимодействия между PD-1 и PD-L1 или CTLA4 и CD80 / 86, взаимодействия между PD-1 или CTLA4 и его лигандом действуют, чтобы контролировать активность Т-клеток, предотвращая сверхактивные иммунные ответы (199). . Иммунотерапия с использованием моноклональных антител против PD-1 или против CTLA4 эффективна в борьбе с прогрессированием различных видов рака, и микробиота кишечника может влиять на то, будут ли определенные люди более положительно реагировать на терапию (199, 200).Например, повышенные уровни комменсальной бактерии Akkermansia muciniphila наблюдались у пациентов, которые положительно отреагировали на лечение (200).

Заключение

Несмотря на то, что многое было сделано для определения того, как APC взаимодействуют с Т-клетками, следует расширить некоторые аспекты. Во-первых, следует дополнительно изучить, как бактерии влияют на взаимодействия APC с иммунными клетками для борьбы с микробными инфекциями. Взаимодействие между передачей сигналов микробиоты и возникновением рака также требует лучшего понимания.Несмотря на то, что в этом обзоре не рассматривается широко, следует изучить потенциальные иммунотерапевтические методы, касающиеся изменения APC или функции микробиоты. Точно так же требуется лучшее понимание того, как опухоли развивают стратегии использования иммунных клеток для стимулирования туморогенеза и подавления Т-клеточных ответов, особенно в отношении системы PD-1. Наконец, необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, как факторы, происходящие от микробиоты, включая SCFAs и кишечные эпителиальные клетки, формируют APC и взаимодействия иммунных клеток.

Авторские взносы

SG написал рукопись и разработал рисунки. П.К. отредактировал текст.

Финансирование

Эта работа была поддержана Фондом Крона и колита (476637), Национальным обществом рассеянного склероза (PP-1709-29192) и Исследовательским фондом SUNY для PK, а также стипендиями для аспирантов Национального научного фонда для SG.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Майкла Бопре и Сюнь Линь за их вклад.

Список литературы

2. Kaiko GE, Horvat JC, Beagley KW, Hansbro PM. Принятие иммунологического решения: как иммунная система решает создать ответ Т-хелперных клеток? Иммунология. (2008) 123: 326–38. DOI: 10.1111 / j.1365-2567.2007.02719.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Брэдли Л.М., Далтон Д.К., Крофт М.Непосредственная роль IFN-гамма в регуляции развития клеток Th2. J Immunol Baltim Md 1950. (1996) 157: 1350–1358.

PubMed Аннотация | Google Scholar

5. Кастро Ф., Кардосо А. П., Гонсалвес Р. М., Серр К., Оливейра М. Дж. Гамма-интерферон на перекрестке иммунного надзора за опухолью или его уклонения. Front Immunol. (2018) 9: 847. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.00847

CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Халле С., Кейзер К.А., Шталь Ф.Р., Буше А., Марквардт А., Чжэн Х и др. In vivo способность цитотоксических Т-клеток к уничтожению ограничена и включает динамические взаимодействия и кооперативность Т-клеток. Иммунитет. (2016) 44: 233–45. DOI: 10.1016 / j.immuni.2016.01.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Madera S, Sun JC. Передний край: специфическая потребность стадии IL-18 для размножения противовирусных NK-клеток. J Immunol Baltim Md 1950. (2015) 194: 1408–12. DOI: 10.4049 / jimmunol.1402001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.ten Broeke T, Wubbolts R, Stoorvogel W. Презентация антигена класса II MHC дендритными клетками регулируется посредством эндосомного сортировки. Cold Spring Harb Perspect Biol. (2013) 5: a016873. DOI: 10.1101 / cshperspect.a016873

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Holmlund U, Cebers G, Dahlfors AR, Sandstedt B, Bremme K, Ekström ES и др. Экспрессия и регуляция рецепторов распознавания образов Toll-подобного рецептора-2 и Toll-подобного рецептора-4 в плаценте человека. Иммунология. (2002) 107: 145–51. DOI: 10.1046 / j.1365-2567.2002.01491.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Ян Х., Вей Дж., Чжан Х., Линь Л., Чжан В., Хе С. Повышение экспрессии Toll-подобного рецептора (TLR) и высвобождение цитокинов из тучных клеток P815 с помощью GM-CSF. BMC Cell Biol. (2009) 10:37. DOI: 10.1186 / 1471-2121-10-37

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Фуката М., Вамадеван А.С., Абреу М.Т.Toll-подобные рецепторы (TLR) и Nod-подобные рецепторы (NLR) при воспалительных заболеваниях. Semin Immunol. (2009) 21: 242–53. DOI: 10.1016 / j.smim.2009.06.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Фицджеральд К.А., Роу, округ Колумбия, Барнс Б.Дж., Кэффри Д.Р., Визинтин А., Латц Э. и др. LPS-TLR4 Передача сигналов к IRF-3/7 и NF-κB задействует адаптеры платы за проезд TRAM и TRIF. J Exp Med. (2003) 198: 1043–55. DOI: 10.1084 / jem.20031023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18.Verstak B, Nagpal K, Bottomley SP, Golenbock DT, Hertzog PJ, Mansell A. Взаимодействие, подобное адаптеру MyD88 (Mal) / TIRAP с TRAF6, является критическим для TLR2- и TLR4-опосредованных провоспалительных реакций NF-kappaB. J Biol Chem. (2009) 284: 24192–203. DOI: 10.1074 / jbc.M109.023044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Burgdorf S, Kautz A, Bohnert V, Knolle PA, Kurts C. Четкие пути захвата антигена и внутриклеточная маршрутизация при активации CD4 и CD8 Т-клеток. Наука. (2007) 316: 612–6. DOI: 10.1126 / science.1137971

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Делнест Й., Магистрелли Дж., Гошат Дж., Хэув Дж., Обри Дж., Накамура К. и др. Участие LOX-1 в перекрестной презентации антигена, опосредованной дендритными клетками. Иммунитет. (2002) 17: 353–62. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (02) 00388-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Wieczorek M, Abualrous ET, Sticht J, Álvaro-Benito M, Stolzenberg S, Noé F, et al.Белки главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и MHC класса II: конформационная пластичность в представлении антигена. Front Immunol. (2017) 8: 292. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00292

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Тай Й., Ван К., Корнер Х., Чжан Л., Вэй В. Молекулярные механизмы активации Т-клеток дендритными клетками при аутоиммунных заболеваниях. Фронт. Pharmacol. (2018) 9: 642. DOI: 10.3389 / fphar.2018.00642

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Cani PD, Bibiloni R, Knauf C, Waget A, Neyrinck AM, Delzenne NM, et al. Изменения микробиоты кишечника контролируют воспаление, вызванное метаболической эндотоксемией, при ожирении и диабете, вызванном диетой с высоким содержанием жиров. Диабет. (2008) 57: 1470–81. DOI: 10.2337 / db07-1403

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Вен Л., Лей Р. Е., Волчков П. Ю., Странджес П. Б., Аванесян Л., Стоунбрейкер А. С. и др. Врожденный иммунитет и микробиота кишечника в развитии диабета 1 типа. Природа. (2008) 455: 1109–13. DOI: 10.1038 / nature07336

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Кумар П., Монин Л., Кастильо П., Эльсегейни В., Хорн В., Эдденс Т. и др. Передача сигналов рецептора интерлейкина-17 в кишечнике опосредует взаимный контроль микробиоты кишечника и аутоиммунного воспаления. Иммунитет. (2016) 44: 659–71. DOI: 10.1016 / j.immuni.2016.02.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Сокол Х., Пиньер Б., Ваттерлот Л., Лахдари О., Бермудес-Хумаран Л.Г., Гратаду Дж. Дж. И др. Faecalibacterium prausnitzii - это противовоспалительная комменсальная бактерия, выявленная при анализе кишечной микробиоты пациентов с болезнью Крона. Proc Natl Acad Sci USA. (2008) 105: 16731–6. DOI: 10.1073 / pnas.0804812105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Flannigan KL, Geem D, Harusato A, Denning TL. Антигенпрезентирующие клетки кишечника: ключевые регуляторы иммунного гомеостаза и воспаления. Am J Pathol. (2015) 185: 1809–19. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2015.02.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Деннинг Т.Л., Ван И, Патель С.Р., Уильямс И.Р., Пулендран Б. Макрофаги и дендритные клетки Lamina propria по-разному индуцируют регуляторные и производящие интерлейкин 17 Т-клеточные ответы. Nat Immunol. (2007) 8: 1086–94. DOI: 10.1038 / ni1511

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35.Мурай М., Туровская О., Ким Дж., Мадан Р., Карп С.Л., Черутре Х. и др. Интерлейкин 10 действует на регуляторные Т-клетки, поддерживая экспрессию фактора транскрипции Foxp3 и подавляя функцию у мышей с колитом. Nat Immunol. (2009) 10: 1178–84. DOI: 10.1038 / ni.1791

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Хадис Ю., Валь Б., Шульц О., Хардтке-Воленски М., Шипперс А., Вагнер Н. и др. Кишечная толерантность требует нахождения в кишечнике и экспансии регуляторных Т-клеток FoxP3 + в собственной пластинке. Иммунитет. (2011) 34: 237–46. DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.01.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Йоханссон-Линдбом Б., Свенссон М., Вурбель М.А., Малиссен Б., Маркес Дж., Агаче В. Селективная генерация кишечных тропических Т-клеток в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (GALT): потребность в дендритных клетках GALT и адъюванте. J. Exp. Med. (2003) 198: 963–969. DOI: 10.1084 / jem.20031244

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Мора Дж. Р., Ивата М., Экстин Б., Сонг С. Ю., Джунт Т., Сенман Б. и др. Генерация кишечных IgA-секретирующих b-клеток дендритными клетками кишечника. Наука. (2006) 314: 1157–60. DOI: 10.1126 / science.1132742

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Куни Р., Бейкер Дж., Брейн О, Дэнис Б., Пичулик Т., Аллан П. и др. Стимуляция NOD2 вызывает аутофагию в дендритных клетках, влияя на обработку бактерий и презентацию антигена. Nat Med. (2010) 16: 90–7.DOI: 10,1038 / нм.2069

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. van Beelen AJ, Zelinkova Z, Taanman-Kueter EW, Muller FJ, Hommes DW, Zaat SA, et al. Стимуляция внутриклеточного бактериального сенсора NOD2 программирует дендритные клетки, чтобы способствовать выработке интерлейкина-17 в Т-клетках памяти человека. Иммунитет. (2007) 27: 660–9. DOI: 10.1016 / j.immuni.2007.08.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Brand S, Beigel F, Olszak T, Zitzmann K, Eichhorst ST, Otte JM и др.IL-22 увеличивается при активной болезни Крона и способствует экспрессии провоспалительных генов и миграции кишечных эпителиальных клеток. г. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol. (2006) 290: G827–38. DOI: 10.1152 / ajpgi.00513.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Hölttä V, Klemetti P, Sipponen T., Westerholm-Ormio M, Kociubinski G, Salo H, et al. Иммунитет к IL-23 / IL-17 как признак болезни Крона: Inflamm Bowel Dis. (2008) 14: 1175–84.DOI: 10.1002 / ibd.20475

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Duerr RH, Taylor KD, Brant SR, Rioux JD, Silverberg MS, Daly MJ, et al. Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует IL23R как ген воспалительного заболевания кишечника. Наука. (2006) 314: 1461–3. DOI: 10.1126 / science.1135245

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Лю Дж. З., ван Соммерен С., Хуанг Х., Нг С. К., Альбертс Р., Такахаши А. и др.Анализ ассоциаций идентифицирует 38 локусов восприимчивости к воспалительным заболеваниям кишечника и подчеркивает общий генетический риск в разных популяциях. Nat Genet. (2015) 47: 979–86. DOI: 10,1038 / нг.3359

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Билсборо Дж., Тарган С.Р., Снаппер С.Б. Терапевтические цели при воспалительном заболевании кишечника: настоящее и будущее. Am J Gastroenterol Suppl. (2016) 3: 27–37. DOI: 10.1038 / ajgsup.2016.18

CrossRef Полный текст | Google Scholar

47.Ма К., Джайрат В., Кханна Р., Фиган Б. Г.. Исследуемые препараты в фазе I и фазе клинических испытаний интерлейкина 23 (IL23) для лечения болезни Крона. Exp Opin Invest Drugs. (2018) 1506764: 1–12. DOI: 10.1080 / 13543784.2018.1506764

CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Hueber W., Sands BE, Lewitzky S, Vandemeulebroecke M, Reinisch W., Higgins PD, et al. Секукинумаб, человеческое моноклональное антитело против IL-17A, для лечения умеренной и тяжелой болезни Крона: неожиданные результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования. Gut. (2012) 61: 1693–700. DOI: 10.1136 / gutjnl-2011-301668

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Ли Дж. С., Тато С. М., Джойс-Шейх Б., Гюлен М. Ф., Каятте С., Чен Ю. и др. Интерлейкин-23-независимая продукция IL-17 регулирует проницаемость кишечного эпителия. Иммунитет. (2015) 43: 727–38. DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.09.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Максвелл Дж. Р., Чжан Ю., Браун В. А., Смит К. Л., Бирн Ф. Р., Фиорино М. и др.Различная роль интерлейкина-23 и интерлейкина-17 в иммунорегуляции кишечника. Иммунитет. (2015) 43: 739–50. DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.08.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Перссон EK, Uronen-Hansson H, Semmrich M, Rivollier A, Hägerbrand K, Marsal J, et al. Дендритные клетки CD103 + CD11b +, зависимые от транскрипционного фактора IRF4, управляют дифференцировкой T-хелперов 17 слизистой оболочки. Иммунитет. (2013) 38: 958–69. DOI: 10.1016 / j.immuni.2013.03.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Ли Ю.К., Менезес Дж.С., Умесаки Ю., Мазманян С.К. Реакция провоспалительных Т-клеток на кишечную микробиоту способствует экспериментальному аутоиммунному энцефаломиелиту. Proc Natl Acad Sci USA. (2011) 108: 4615–22. DOI: 10.1073 / pnas.1000082107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Иванов И.И., Атараши К., Манель Н., Броди Е.Л., Шима Т., Караоз У и др.Индукция кишечных клеток Th27 сегментированными нитчатыми бактериями. Ячейка. (2009) 139: 485–98. DOI: 10.1016 / j.cell.2009.09.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Габорио-Ротио В., Ракотобе С., Лекуйе Э., Малдер И., Лан А., Бридонно С. и др. Ключевая роль сегментированных нитчатых бактерий в скоординированном созревании ответов Т-хелперных клеток кишечника. Иммунитет. (2009) 31: 677–89. DOI: 10.1016 / j.immuni.2009.08.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55.Ян Й., Торчинский М.Б., Гоберт М., Сюн Х., Сюй М., Линехан Д.Л. и др. Сфокусированная специфичность кишечных клеток Th27 по отношению к комменсальным бактериальным антигенам. Природа. (2014) 510: 152–6. DOI: 10.1038 / природа13279

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Панеа С., Фаркас А.М., Гото Й., Абдоллахи-Рудсаз С., Ли С., Коссо Б. и др. Макрофаги, происходящие из кишечных моноцитов, контролируют комменсальные реакции Th27. Cell Rep. (2015) 12: 1314–24.DOI: 10.1016 / j.celrep.2015.07.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Атараси К., Тануэ Т., Андо М., Камада Н., Нагано И., Нарушима С. и др. Индукция клеток Th27 путем адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника. Ячейка. (2015) 163: 367–80. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.08.058

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Бене К., Варга З., Петров В.О., Бойко Н., Райнаволгий Э. Виды кишечной микробиоты могут вызывать как воспалительные, так и толерогенные иммунные реакции в дендритных клетках человека, опосредованные альфа-лигированием рецептора ретиноевой кислоты. Front Immunol. (2017) 8: 427. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.00427

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Лю Х., Чен Ф., Ву В., Цао А.Т., Сюэ Х, Яо С. и др. TLR5 опосредует CD172α + индукцию дендритными клетками собственной пластинки кишечника Th27 клеток. Научный отчет (2016) 6: 22040. DOI: 10.1038 / srep22040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Ши В.Ф., Кокс Дж., Клявин Н.М., Денглер Х.С., Райхельт М., Кумар П. и др.Передача сигналов гомеостатического рецептора IL-23 ограничивает ответ Th27 за счет опосредованного IL-22 сдерживания комменсальной микробиоты. Proc Natl Acad Sci USA. (2014) 111: 13942–7. DOI: 10.1073 / pnas.1323852111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

61. Фланниган К.Л., Нго В.Л., Джем Д., Харусато А., Хирота С.А., Паркос Калифорния и др. Рекрутирование нейтрофилов, опосредованное IL-17A, ограничивает распространение сегментированных нитчатых бактерий. Mucosal Immunol. (2017) 10: 673–84.DOI: 10.1038 / mi.2016.80

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62. Ли Й., Авасти А., Йосеф Н., Кинтана Ф.Дж., Сяо С., Петерс А. и др. Индукция и молекулярная сигнатура патогенных клеток Th27. Nat Immunol. (2012) 13: 991–9. DOI: 10.1038 / ni.2416

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Codarri L, Gyülvészi G, Tosevski V, Hesske L, Fontana A, Magnenat L, et al. RORγt управляет выработкой цитокина GM-CSF в хелперных Т-клетках, что важно для эффекторной фазы аутоиммунного нейровоспаления. Nat Immunol. (2011) 12: 560–7. DOI: 10.1038 / ni.2027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Haghikia A, Jörg S, Duscha A, Berg J, Manzel A, Waschbisch A, et al. Пищевые жирные кислоты напрямую влияют на аутоиммунитет центральной нервной системы через тонкий кишечник. Иммунитет. (2015) 43: 817–29. DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.09.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65. Атараси К., Тануэ Т., Осима К., Суда В., Нагано И., Нисикава Х. и др.Индукция Treg рационально подобранной смесью штаммов Clostridia из микробиоты человека. Природа. (2013) 500: 232–6. DOI: 10.1038 / nature12331

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Раунд JL, Мазманян СК. Индуцируемое развитие Foxp3 + регуляторных Т-клеток комменсальной бактерией кишечной микробиоты. Proc Natl Acad Sci USA. (2010) 107: 12204–9. DOI: 10.1073 / pnas.02107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

67.Дасгупта С., Эртурк-Хасдемир Д., Очоа-Репараз Дж., Райнекер Х.С., Каспер Д.Л. Плазмацитоидные дендритные клетки опосредуют противовоспалительные реакции на кишечную комменсальную молекулу через врожденные и адаптивные механизмы. Клеточный микроб-хозяин. (2014) 15: 413–23. DOI: 10.1016 / j.chom.2014.03.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Кашиваги И., Морита Р., Шичита Т., Комай К., Саеки К., Мацумото М. и др. Smad2 и Smad3 обратно регулируют аутоиндукцию TGF-β в дендритных клетках, активированных Clostridium butyricum . Иммунитет. (2015) 43: 65–79. DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.06.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Фурусава Ю., Обата Ю., Фукуда С., Эндо Т.А., Накато Г., Такахаши Д. и др. Бутират, полученный из комменсальных микробов, индуцирует дифференцировку регуляторных Т-клеток толстой кишки. Природа. (2013) 504: 446–50. DOI: 10.1038 / природа12721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70. Арпайя Н., Кэмпбелл С., Фан Х, Дикий С., ван дер Викен Дж., ДеРоос П. и др.Метаболиты, продуцируемые комменсальными бактериями, способствуют образованию периферических регуляторных Т-клеток. Природа. (2013) 504: 451–5. DOI: 10.1038 / nature12726

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. Сингх Н., Гурав А., Шивапракасам С., Брейди Е., Падиа Р., Ши Х и др. Активация Gpr109a, рецептора ниацина и бутирата метаболита комменсала, подавляет воспаление толстой кишки и канцерогенез. Иммунитет. (2014) 40: 128–39. DOI: 10.1016 / j.иммунитет.2013.12.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Латроп С.К., Блум С.М., Рао С.М., Натч К., Лио С.В., Сантакруз Н. и др. Периферическое образование иммунной системы комменсальной микробиотой толстой кишки. Природа. (2011) 478: 250–4. DOI: 10.1038 / nature10434

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C, et al. Метаболизм пищевых волокон кишечной микробиотой влияет на аллергические заболевания дыхательных путей и кроветворение. Нац. Med. (2014) 20: 159–66. DOI: 10,1038 / нм.3444

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Киннебрю М.А., Баффи К.Г., Диль Г.Е., Зеневич Л.А., Лейнер И., Холь TM и др. Продукция интерлейкина 23 дендритными клетками CD103 + CD11b + кишечника в ответ на бактериальный флагеллин усиливает врожденную иммунную защиту слизистой оболочки. Иммунитет. (2012) 36: 276–87. DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.12.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

76.Hepworth MR, Monticelli LA, Fung TC, Ziegler CG, Grunberg S, Sinha R, et al. Врожденные лимфоидные клетки регулируют CD4 + Т-клеточные ответы на кишечные комменсальные бактерии. Природа. (2013) 498: 113–7. DOI: 10.1038 / природа12240

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77. Castellanos JG, Woo V, Viladomiu M, Putzel G, Lima S, Diehl GE, et al. Индуцированный микробиотой TNF-подобный лиганд 1A управляет защитой барьера группы 3, опосредованной врожденными лимфоидными клетками, и активацией кишечных Т-клеток во время колита. Иммунитет. (2018) 49: 1077–89.e5. DOI: 10.1016 / j.immuni.2018.10.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

80. Альбигер Б., Дальберг С., Энрикес-Нормарк Б., Нормарк С. Роль врожденной иммунной системы в защите хозяина от бактериальных инфекций: фокус на Toll-подобных рецепторах. J Intern Med. (2007) 261: 511–28. DOI: 10.1111 / j.1365-2796.2007.01821.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82.Morooka T, Umeda A, Amako K. Подвижность как фактор колонизации кишечника для campylobacter jejuni. Микробиология. (1985) 131: 1973–80.

PubMed Аннотация | Google Scholar

83. O'Neil HS, Marquis, H. Listeria monocytogenes жгутики используются для подвижности, а не в качестве адгезинов, для увеличения инвазии клеток-хозяев. Infect Immun. (2006) 74: 6675–81. DOI: 10.1128 / IAI.00886-06

CrossRef Полный текст | Google Scholar

84. Таллант Т., Деб А., Кар Н., Лупика Дж., Де Вир М.Дж., ДиДонато Дж.А.Флагеллин, действующий через TLR5, является основным активатором ключевых сигнальных путей, ведущих к NF-каппа B и активации программы провоспалительных генов в эпителиальных клетках кишечника. BMC Microbiol. (2004) 4:33. DOI: 10.1186 / 1471-2180-4-33

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

85. Chassaing B, Ley RE, Gewirtz AT. Толл-подобный рецептор 5 кишечных эпителиальных клеток регулирует кишечную микробиоту, предотвращая слабое воспаление и метаболический синдром у мышей. Гастроэнтерология. (2014) 147: 1363–77.e17. DOI: 10.1053 / j.gastro.2014.08.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Аггарвал С., Гиларди Н., Се М.-Х., де Соваж Ф.Дж., Герни А.Л. Интерлейкин-23 способствует определенному состоянию активации CD4 Т-клеток, характеризующемуся выработкой интерлейкина-17. J Biol Chem. (2003) 278: 1910–4. DOI: 10.1074 / jbc.M207577200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88.Пак Х., Ли З., Ян Х. О., Чанг Ш., Нуриева Р., Ван Й. Х. и др. Отдельная ветвь CD4 Т-клеток регулирует воспаление тканей, продуцируя интерлейкин 17. Nat Immunol. (2005) 6: 1133–41. DOI: 10.1038 / ni1261

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

90. Girardin SE, Boneca IG, Viala J, Chamaillard M, Labigne A, Thomas G, et al. Nod2 - это общий датчик пептидогликана посредством обнаружения мурамилдипептида (MDP). J Biol Chem. (2003) 278: 8869–72.DOI: 10.1074 / jbc.C200651200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

91. Ватанабе Т., Китани А., Мюррей П. Дж., Стробер В. NOD2 является негативным регулятором опосредованных Toll-подобным рецептором 2 ответов Т-хелперов 1 типа. Nat Immunol. (2004) 5: 800–8. DOI: 10.1038 / ni1092

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

92. Лисицын Н.А., Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Краснов Г.С., Сыкулев Ю.А., Берестень С.Ф. Кишечные альфа-дефенсины в норме и патологии. Ann Clin Microbiol Antimicrob. (2012) 11: 1. DOI: 10.1186 / 1476-0711-11-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

93. Hallstrom K, McCormick BA. Взаимодействие сальмонеллы со слизистой оболочкой кишечника и прохождение через нее: через хрусталик организма. Front Microbiol. (2011) 2:88. DOI: 10.3389 / fmicb.2011.00088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

95. Блэквелл Дж. М., Госвами Т., Эванс КА, Сибторп Д., Папо Н., Уайт Дж. К. и др.SLC11A1 (ранее NRAMP1) и устойчивость к болезням. Cell Microbiol. (2001) 3: 773–84. DOI: 10.1046 / j.1462-5822.2001.00150.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

97. Зарепур М., Бхуллар К., Монтеро М., Ма К., Хуанг Т., Велчич А. и др. Муцин muc2 ограничивает количество патогенов и дисфункцию эпителиального барьера при колите, вызванном сальмонеллой энтерикой, сероварным тифимуриумом. Infect Immun. (2013) 81: 3672–83. DOI: 10.1128 / IAI.00854-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

98.Voedisch S, Koenecke C, David S, Herbrand H, Förster R, Rhen M и др. Брыжеечные лимфатические узлы ограничивают опосредованное дендритными клетками распространение salmonella enterica serovar typhimurium и ограничивают системное заболевание у мышей. Заражение. Иммун. (2009) 77: 3170–80. DOI: 10.1128 / IAI.00272-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

99. Сирилло Д.М., Вальдивия Р.Х., Монак Д.М., Фалькоу С. Макрофагозависимая индукция системы секреции типа III острова патогенности Salmonella и ее роль во внутриклеточном выживании. Mol Microbiol. (1998) 30: 175–88.

PubMed Аннотация | Google Scholar

100. van der Velden AWM, Copass MK, Starnbach MN. Сальмонеллы подавляют пролиферацию Т-клеток за счет прямого, контактно-зависимого иммуносупрессивного действия. Proc Natl Acad Sci USA. (2005) 102: 17769–74. DOI: 10.1073 / pnas.0504382102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

101. Tripp CS, Wolf SF, Unanue ER. Интерлейкин 12 и фактор некроза опухоли альфа являются костимуляторами продукции гамма-интерферона естественными клетками-киллерами у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом с листериозом, а интерлейкин 10 является физиологическим антагонистом. Proc Natl Acad Sci USA. (1993) 90: 3725–29.

PubMed Аннотация | Google Scholar

102. Myers JT, Tsang AW, Swanson JA. Локализованные промежуточные соединения реактивного кислорода и азота препятствуют выходу Listeria monocytogenes из вакуолей в активированных макрофагах. J Immunol. (2003) 171: 5447–53.

PubMed Аннотация | Google Scholar

103. Борегар К.Е., Ли К.Д., Кольер Р.Дж., Суонсон Дж.А. pH-зависимая перфорация фагосом макрофагов листериолизином O из Listeria monocytogenes . J Exp Med. (1997) 186: 1159–63.

PubMed Аннотация | Google Scholar

104. Carrero JA, Calderon B, Unanue ER. Лимфоциты вредны во время раннего врожденного иммунного ответа против Listeria monocytogenes . J Exp Med. (2006) 203: 933–40. DOI: 10.1084 / jem.20060045

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

106. Сенда Т., Догра П., Гранот Т., Фурухаши К., Снайдер М.К., Тапа П. и др. Микроанатомический анализ Т-клеточного иммунитета кишечника человека выявляет сайт-специфические изменения в лимфоидных тканях, ассоциированных с кишечником, в течение жизни. Mucosal Immunol. (2018) 12: 378–89. DOI: 10.1038 / s41385-018-0110-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

107. Джанг М.Х., Сугава Н., Танака Т., Хирата Т., Хирои Т., Тохья К. и др. CCR7 критически важен для миграции дендритных клеток собственной пластинки кишечника в мезентериальные лимфатические узлы. J Immunol Baltim Md 1950. (2006) 176: 803–10. DOI: 10.4049 / jimmunol.176.2.803

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

108.Qiu Z, Khairallah C, Sheridan BS. Listeria monocytogenes : модельный патоген продолжает уточнять наши знания об ответе Т-клеток cd8. Pathog Basel Switz. (2018) 7: E55. DOI: 10.3390 / pathogens7020055

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

109. Ивата М., Хиракияма А., Эшима Ю., Кагэчика Х., Като С., Сонг С.Ю. Ретиноевая кислота накладывает отпечаток специфичности на Т-лимфоциты. Иммунитет. (2004) 21: 527–38. DOI: 10.1016 / j.immuni.2004.08.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

110. Зильбергер Д. Д., Зиндл С. Л., Уивер Коннектикут. Citrobacter rodentium : модельный энтеропатоген для понимания взаимодействия врожденных и адаптивных компонентов иммунитета 3 типа. Mucosal Immunol. (2017) 10: 1108–17. DOI: 10,1038 / mi.2017.47

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

111. Королева Е.П., Гальперин С., Губернаторова Е.О., Мачо-Фернандес Э., Спенсер С.М., Туманов А.В. Колит, вызванный Citrobacter rodentium : надежная модель для изучения иммунных реакций слизистой оболочки кишечника. J Immunol Methods. (2015) 421: 61–72. DOI: 10.1016 / j.jim.2015.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

112. Лай Й, Розеншин И., Леонг Дж. М., Франкель Г. Интимная привязанность к хозяину: энтеропатогенная и энтерогеморрагическая Escherichia coli : интимная адгезия EPEC и EHEC. Cell Microbiol. (2013) 15: 1796–808.DOI: 10,1111 / cmi.12179

CrossRef Полный текст | Google Scholar

113. Валланс Б.А., Дэн В., Кнодлер Л.А., Финлей Б.Б. У мышей, лишенных Т- и В-лимфоцитов, развивается преходящий колит и гиперплазия крипт, но при заражении Citrobacter rodentium нарушается бактериальный клиренс. Заражение. Иммун. (2002) 70: 2070–81. DOI: 10.1128 / IAI.70.4.2070-2081.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

114. Лупп С., Робертсон М.Л., Викхэм М.Э., Секиров И., Чемпион О.Л., Гейнор Е.К. и др.Опосредованное хозяином воспаление нарушает микробиоту кишечника и способствует чрезмерному росту энтеробактерий. Клеточный микроб-хозяин. (2007) 2: 119–29. DOI: 10.1016 / j.chom.2007.06.010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

115. Фам Т.А., Клэр С., Гулдинг Д., Арасте Дж. М., Старес М.Д., Браун HP и др. Эпителиальное IL-22RA1-опосредованное фукозилирование способствует устойчивости кишечной колонизации к условно-патогенным микроорганизмам. Клеточный микроб-хозяин. (2014) 16: 504–16.DOI: 10.1016 / j.chom.2014.08.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

116. Chen J, Waddell A, Lin Y-D, Cantorna MT. Дисбиоз, вызванный дефицитом рецептора витамина D, придает устойчивость к колонизации Citrobacter rodentium за счет модуляции врожденных лимфоидных клеток. Mucosal Immunol. (2015) 8: 618–26. DOI: 10,1038 / mi.2014.94

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

117. Zheng Y, Valdez PA, Danilenko DM, Hu Y, Sa SM, Gong Q, et al.Интерлейкин-22 обеспечивает раннюю защиту хозяина от прикрепления и уничтожения бактериальных патогенов. Nat Med. (2008) 14: 282–9. DOI: 10,1038 / нм1720

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

118. Басу Р., О'Куинн Д. Б., Силбергер Д. Д., Шеб Т. Р., Фоузер Л., Оуян В. и др. Клетки Th32 являются важным источником IL-22 для защиты хозяина от энтеропатогенных бактерий. Иммунитет. (2012) 37: 1061–75. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.08.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

119.Ханаш А.М., Дудаков Дж. А., Хуа Г., О'Коннор М. Х., Янг Л. Ф., Сингер Н. В. и др. Интерлейкин-22 защищает стволовые клетки кишечника от иммуноопосредованного повреждения тканей и регулирует чувствительность к реакции трансплантат против хозяина. Иммунитет. (2012) 37: 339–50. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.05.028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

120. Бергман М.А., Лумис В.П., Мексас Дж., Штарнбах М.Н., Исберг Р.Р. CD8 + Т-клетки ограничивают инфекцию yersinia pseudotuberculosis : обход антифагоцитоза путем нацеливания на антигенпрезентирующие клетки. PLoS Pathog. (2009) 5: e1000573.

PubMed Аннотация | Google Scholar

121. Zhang Y, Mena P, Romanov G, Lin JS, Smiley ST, Bliska JB. Защитный эпитоп в эффекторном япе типа III является основным антигеном Т-лимфоцитов CD8 во время первичного инфицирования Yersinia pseudotuberculosis . Заражение. Иммун. (2012) 80: 206–14. DOI: 10.1128 / IAI.05971-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

122. Lin, J.-S., Szaba FM, Kummer LW, Chromy, B.A, Smiley, S. T. Yersinia pestis YopE содержит доминантный Т-клеточный эпитоп CD8, который обеспечивает защиту в мышиной модели легочной чумы. Дж. Иммунол Балтим М. Д. 1950. (2011) 187: 897–904.

123. Шен Х, Гонсалес-Хуарбе Н., Бланшетт К., Кримминс Дж., Бергман М.А., Исберг Р.Р. и др. CD8 + Т-клетки, специфичные к одному эпитопу Yersinia pseudotuberculosis , ограничивают репликацию бактерий в печени, но не обеспечивают стерилизующий иммунитет. Infect Genet Evol. (2016) 43: 289–96. DOI: 10.1016 / j.meegid.2016.06.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

124. Гонсалес-Хуарбе Н., Шен Х., Бергман М.А., Ориуэла С.Дж., Дубе PH. YopE-специфические CD8 + Т-клетки обеспечивают защиту от системной инфекции и инфекции слизистых оболочек Yersinia pseudotuberculosis . PLoS ONE. (2017) 12: e0172314. DOI: 10.1371 / journal.pone.0172314

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

125.Бергсбакен Т., Беван М.Дж. Провоспалительная микросреда кишечника регулирует дифференцировку резидентных в ткани CD8 + Т-клеток, отвечающих на инфекцию. Nat Immunol. (2015) 16: 406–14. DOI: 10.1038 / ni.3108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

126. Сигель Р.Л., Миллер К.Д., Федева С.А., Анен Д.Д., Мистер Р.Г.С., Барзи А. и др. Статистика колоректального рака, 2017: статистика колоректального рака, 2017. CA Cancer J Clin. (2017) 67: 177–93. DOI: 10.3322 / caac.21395

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

127. Армагани Т., Уилсон Дж. Д., Чу, К., Миллс Г. Генетические изменения при колоректальном раке. Gastrointest Cancer Res. (2012) 5: 19–27.

PubMed Аннотация | Google Scholar

129. Grizzi F, Bianchi P, Malesci A, Laghi L. Прогностическое значение врожденного и адаптивного иммунитета при колоректальном раке. World J Gastroenterol. (2013) 19: 174–84.DOI: 10.3748 / wjg.v19.i2.174

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

131. Додж Иллинойс, Карр М.В., Сернадас, М., Бреннер М.Б. Продукция IL-6 легочными дендритными клетками препятствует иммунным ответам Th2. J Immunol Baltim Md 1950. (2003) 170: 4457–64. DOI: 10.4049 / jimmunol.170.9.4457

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

132. Беринштейн Н.Л. Карциноэмбриональный антиген как мишень для терапевтических противораковых вакцин: обзор. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. (2002) 20: 2197–207. DOI: 10.1200 / JCO.2002.08.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

133. Аджиока Ю., Эллисон Л.Дж., Джасс-младший. Значение экспрессии муцина MUC1 и MUC2 при колоректальном раке. J Clin Pathol. (1996) 49: 560–4.

PubMed Аннотация | Google Scholar

134. Speetjens FM, Kuppen PJ, Welters MJ, Essahsah F, Voet van den Brink AM, Lantrua MG, et al. Индукция p53-специфического иммунитета с помощью синтетической длиннопептидной вакцины p53 у пациентов, леченных от метастатического колоректального рака. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. (2009) 15: 1086–95. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-08-2227

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

135. Нури-Ширази М., Баншеро Дж., Белл Д., Беркхолдер С., Краус Е. Т., Даву Дж. И др. Дендритные клетки захватывают убитые опухолевые клетки и представляют свои антигены, чтобы вызвать опухолеспецифические иммунные ответы. J Immunol. (2000) 165: 3797–803. DOI: 10.4049 / jimmunol.165.7.3797

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

137.Апето Л., Гирингелли Ф., Тесниер А., Обейд М., Ортис С., Криолло А. и др. Вклад иммунной системы, зависимый от Toll-подобного рецептора 4, в противоопухолевую химиотерапию и лучевую терапию. Nat Med. (2007) 13: 1050–9. DOI: 10,1038 / нм1622

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

138. Мессмер Д., Ян Х., Телусма Дж., Нолл Ф., Ли Дж., Мессмер Б. и др. Белок 1 группы с высокой подвижностью: эндогенный сигнал для созревания дендритных клеток и поляризации th2. J Immunol. (2004) 173: 307–13. DOI: 10.4049 / jimmunol.173.1.307

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

139. Зитвогель Л., Кепп О., Сеновилла Л., Менгер Л., Чапут Н., Кремер Г. Гибель иммуногенных опухолевых клеток для оптимальной противоопухолевой терапии: путь воздействия кальретикулина. Clin Cancer Res. (2010) 16: 3100–4. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-09-2891

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

140. Кадихара М., Такакура К., Канаи Т., Ито З., Сайто К., Таками С. и др.Иммунотерапия рака толстой кишки на основе дендритных клеток. World J Gastroenterol. (2016) 22: 4275–86. DOI: 10.3748 / wjg.v22.i17.4275

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

141. Вальдманн Т.А. Общие и противоположные роли IL2 и IL15 в жизни и смерти нормальных и неопластических лимфоцитов: значение для терапии рака. Cancer Immunol Res. (2015) 3: 219–27. DOI: 10.1158 / 2326-6066.CIR-15-0009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

142.Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, Rauch C, Srinivasan S, Fung V и др. Клонирование фактора роста Т-клеток, который взаимодействует с бета-цепью рецептора интерлейкина-2. Наука. (1994) 264: 965–8. DOI: 10.1126 / science.8178155

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

144. Кахан С.М., Бакши Р.К., Лютер Р., Харрингтон Л.Е., Кертис Хендриксон Р., Зажак А.Дж. и др. Производящие и непродуцирующие IL-2 эффекторные Т-клетки CD8 фенотипически и транскрипционно сливаются с образованием подмножеств памяти со сходными защитными свойствами. J Immunol. (2017) 198: 212.6.

Google Scholar

145. Сойка Д.К., Брюникель Д., Шварц Р.Х., Сингх Нью-Джерси. Секреция IL-2 CD4 + T-клетками in vivo является быстрой, временной и находится под влиянием TCR-специфической конкуренции. J Immunol. (2004) 172: 6136–43. DOI: 10.4049 / jimmunol.172.10.6136

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

146. Грануччи Ф., Виззарделли С., Павелка Н., Фо С., Персико М., Вирци Е. и др. Индуцируемая продукция IL-2 дендритными клетками, выявленная с помощью глобального анализа экспрессии генов. Nat Immunol. (2001) 2: 882–8. DOI: 10.1038 / ni0901-882

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

147. Yui MA, Sharp LL, Havran WL, Rothenberg EV. Предпочтительная активация трансгена регуляторной последовательности IL-2 в TCR гамма-дельта и NKT-клетках: субпопуляционные различия в регуляции IL-2. Дж Иммунол Балтим. Md 1950. (2004) 172: 4691–9. DOI: 10.4049 / jimmunol.172.8.4691

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

149.Хенни С.С., Курибаяши К., Керн Д.Е., Гиллис С. Интерлейкин-2 увеличивает активность естественных клеток-киллеров. Природа. (1981) 291: 335–8.

PubMed Аннотация | Google Scholar

150. Ван К.С., Франк Д.А., Ритц Дж. Интерлейкин-2 усиливает ответ естественных клеток-киллеров на интерлейкин-12 посредством активации рецептора интерлейкина-12 и STAT4. Кровь. (2000) 95: 3183–90.

PubMed Аннотация | Google Scholar

151. Камимура Д., Беван М.Дж.Наивные CD8 + Т-клетки дифференцируются в клетки, подобные защитной памяти, после лечения комплексом IL-2 – анти – IL-2 in vivo . J Exp Med. (2007) 204: 1803–12. DOI: 10.1084 / jem.20070543

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

152. Думс Х, Волслегель К., Лин П., Аббас А.К. Интерлейкин-2 усиливает память Т-клеток CD4 + , способствуя образованию клеток, экспрессирующих IL-7Rα. J Exp Med. (2007) 204: 547–57. DOI: 10.1084 / jem.20062381

CrossRef Полный текст | Google Scholar

153. Маттей Ф., Скьявони Дж., Беларделли Ф., Таф Д.Ф. IL-15 экспрессируется дендритными клетками в ответ на IFN типа I, двухцепочечную РНК или липополисахарид и способствует активации дендритных клеток. J Immunol. (2001) 167: 1179–87. DOI: 10.4049 / jimmunol.167.3.1179

CrossRef Полный текст | Google Scholar

155. Doherty TM, Seder RA, Sher A. Индукция и регуляция экспрессии IL-15 в мышиных макрофагах. J Immunol. (1996) 156: 735–41.

PubMed Аннотация | Google Scholar

156. Мишра А., Салливан Л., Калиджури Массачусетс. Молекулярные пути: передача сигналов интерлейкина-15 при здоровье и раке. Clin Cancer Res. (2014) 20: 2044–50. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-12-3603

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

157. Schwartzentruber DJ, Lawson DH, Richards JM, Conry RM, Miller DM, Treisman J, et al. Пептидная вакцина gp100 и интерлейкин-2 у пациентов с запущенной меланомой. N Engl J Med. (2011) 364: 2119–27. DOI: 10.1056 / NEJMoa1012863

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

158. Левин А.М., Бейтс Д.Л., Ринг А.М., Криг С., Лин Дж. Т., Су Л. и др. Использование естественного конформационного переключателя для создания «суперкина» интерлейкина-2. Природа. (2012) 484: 529–33. DOI: 10.1038 / nature10975

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

159. Bahri R, Pateras IS, D'Orlando O, Goyeneche-Patino DA, Campbell M, Polansky JK, et al.IL-15 подавляет канцерогенез толстой кишки, связанный с колитом, индуцируя противоопухолевый иммунитет. Онкоиммунология. (2015) 4: e1002721. DOI: 10.1080 / 2162402X.2014.1002721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

160. Тосолини М., Кириловский А., Млечник Б., Фредриксен Т., Маугер С., Биндеа Г. и др. Клиническое влияние различных классов инфильтрирующих Т-цитотоксических и вспомогательных клеток (Th2, Th3, Treg, Th27) у пациентов с колоректальным раком. Cancer Res. (2011) 71: 1263–71.DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-10-2907

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

161. Лю Дж, Дуань И, Ченг Х, Чен Х, Се В., Лонг Х и др. IL-17 связан с плохим прогнозом и способствует ангиогенезу за счет стимуляции выработки VEGF раковых клеток при колоректальной карциноме. Biochem Biophys Res Commun. (2011) 407: 348–54. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2011.03.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

163. Ван К., Ким М.К., Ди Каро Дж., Вонг Дж., Шалапур С., Ван Дж. И др.Передача сигналов рецептора А интерлейкина-17 в трансформированных энтероцитах способствует раннему колоректальному онкогенезу. Иммунитет. (2014) 41: 1052–63. DOI: 10.1016 / j.immuni.2014.11.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

164. Гривенников С.И., Ван К., Муцида Д., Стюарт К.А., Шнабл Б., Джауч Д. и др. Связанные с аденомой дефекты барьера и микробные продукты вызывают рост опухоли, опосредованный IL-23 / IL-17. Природа. (2012) 491: 254–8. DOI: 10.1038 / природа11465

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

165.Ян Й, Венг В., Пэн Дж., Хун Л., Ян Л., Тояма Й. и др. Fusobacterium nucleatum Увеличивает пролиферацию клеток колоректального рака и развитие опухолей у мышей, активируя передачу сигналов toll-подобного рецептора 4 ядерному фактору-κB и повышая экспрессию MicroRNA-21. Гастроэнтерология. (2017) 152: 851–66.e24 DOI: 10.1053 / j.gastro.2016.11.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

166. Нумасаки М., Фукуши Дж., Оно М., Нарула С.К., Заводный П.Дж., Кудо Т. и др.Интерлейкин-17 способствует ангиогенезу и росту опухоли. Кровь. (2003) 101: 2620–7. DOI: 10.1182 / кровь-2002-05-1461

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

167. Chung AS, Wu X, Zhuang G, Ngu H, Kasman I., Zhang J, et al. Опосредованная интерлейкином-17 паракринная сеть способствует устойчивости опухоли к антиангиогенной терапии. Nat Med. (2013) 19: 1114–23. DOI: 10,1038 / нм 3291

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

168.Ли HJ, Zhuang G, Cao Y, Du P, Kim HJ, Settleman J. Устойчивость к лекарствам через активацию обратной связи Stat3 в онкогензависимых раковых клетках. Cancer Cell. (2014) 26: 207–21. DOI: 10.1016 / j.ccr.2014.05.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

169. Бхаттачарья С., Рэй Р.М., Джонсон Л.Р. STAT3-опосредованная транскрипция Bcl-2, Mcl-1 и c-IAP2 предотвращает апоптоз в клетках, обедненных полиамином. Biochem J. (2005) 392: 335–44. DOI: 10.1042 / BJ20050465

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

170.Xie TX, Wei D, Liu M, Gao AC, Ali-Osman F, Sawaya R и др. Активация Stat3 регулирует экспрессию матриксной металлопротеиназы-2, а также инвазию и метастазирование опухоли. Онкоген. (2004) 23: 3550–60. DOI: 10.1038 / sj.onc.1207383

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

171. Ито М., Мурата Т., Сузуки Т., Шиндох М., Накадзима К., Имаи К. и др. Необходимость активации STAT3 для максимальной индукции коллагеназы-1 (MMP-1) эпидермальным фактором роста и злокачественных характеристик в клетках рака мочевого пузыря Т24. Онкоген. (2006) 25: 1195–204. DOI: 10.1038 / sj.onc.1209149

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

173. Ценг-Рогенский С.С., Хамая Ю., Чой Д.Ю., Каретерс Дж. М.. Интерлейкин 6 изменяет локализацию hMSh4, что приводит к дефектам репарации несоответствия ДНК в клетках колоректального рака. Гастроэнтерология. (2015) 148: 579–89. DOI: 10.1053 / j.gastro.2014.11.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

174. Hirotani T, et al.Ядерный белок I B I BNS избирательно ингибирует индуцированное липополисахаридом производство IL-6 в макрофагах собственной пластинки толстой кишки. J Immunol. (2005) 174: 3650–7. DOI: 10.4049 / jimmunol.174.6.3650

CrossRef Полный текст | Google Scholar

175. Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, Mattson J, Basham B, Sedgwick JD, et al. IL-23 управляет популяцией патогенных Т-клеток, которые вызывают аутоиммунное воспаление. J Exp Med. (2005) 201: 233–40. DOI: 10.1084 / jem.20041257

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

176. Чжоу Л., Иванов И.И., Спольски Р., Мин Р., Шендеров К., Эгава Т. и др. IL-6 программирует дифференцировку клеток T (H) -17, способствуя последовательному включению путей IL-21 и IL-23. Nat Immunol. (2007) 8: 967–74. DOI: 10.1038 / ni1488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

177. Putoczki TL, Thiem S, Loving A, Busuttil RA, Wilson NJ, Ziegler PK, et al.Интерлейкин-11 является доминирующим цитокином семейства IL-6 во время онкогенеза желудочно-кишечного тракта, и на него можно воздействовать терапевтически. Cancer Cell. (2013) 24: 257–71. DOI: 10.1016 / j.ccr.2013.06.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

178. Цзян Р., Ван Х, Дэн Л., Хоу Дж, Ши Р., Яо М. и др. IL-22 связан с развитием рака толстой кишки человека путем активации STAT3. BMC Рак. (2013) 13:59. DOI: 10.1186 / 1471-2407-13-59

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

179.Kryczek I, Lin Y, Nagarsheth N, Peng D, Zhao L, Zhao E, et al. IL-22 + CD4 + Т-клетки. Способствуют стволу колоректального рака посредством активации фактора транскрипции STAT3 и индукции метилтрансферазы DOT1L. Иммунитет. (2014) 40: 772–84. DOI: 10.1016 / j.immuni.2014.03.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

180. Huber S, Gagliani N, Zenewicz LA, Huber FJ, Bosurgi L, Hu B, et al. IL-22BP регулируется инфламмасомой и модулирует онкогенез в кишечнике. Природа. (2012) 491: 259–63. DOI: 10.1038 / природа11535

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

181. Kirchberger S, Royston DJ, Boulard O, Thornton E, Franchini F, Szabady RL, et al. Врожденные лимфоидные клетки поддерживают рак толстой кишки за счет продукции интерлейкина-22 на мышиной модели. J Exp Med. (2013) 210: 917–31. DOI: 10.1084 / jem.20122308

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

183. Гривенников С.И., Туманов А.В., Лиепиньш Д.Д., Круглов А.А., Маракуша Б.И., Шахов А.Н. и др.Отчетливые и неизбыточные функции in vivo и TNF, продуцируемого Т-клетками и макрофагами / нейтрофилами. Иммунитет. (2005) 22: 93–104. DOI: 10.1016 / j.immuni.2004.11.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

184. Сербина Н.В., Салазар-Матер Т.П., Бирон КА, Кузил В.А., Памер Э.Г. Дендритные клетки, продуцирующие TNF / iNOS, опосредуют врожденную иммунную защиту от бактериальной инфекции. Иммунитет. (2003) 19: 59–70. DOI: 10.1016 / S1074-7613 (03) 00171-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

185.Ван Р, Джоу Дж.Дж., Штутцман, Северная Каролина, Цзоу З., Сан П.П. IFN-γ и TNF-α, продуцируемые естественными клетками-киллерами, индуцируют цитолиз клеток-мишеней за счет повышения регуляции ICAM-1. J Leukoc Biol. (2012) 91: 299–309. DOI: 10.1189 / jlb.0611308

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

186. Roulis M, Armaka M, Manoloukos M, Apostolaki M, Kollias G. Клетки кишечного эпителия как продуценты, но не мишени хронического TNF, достаточны для того, чтобы вызвать крона-подобную патологию мыши. Proc Natl Acad Sci USA. (2011) 108: 5396–401. DOI: 10.1073 / pnas.1007811108

CrossRef Полный текст | Google Scholar

187. Попиванова Б.К., Китамура К., Ву Й., Кондо Т., Кагая Т., Канеко С. и др. Блокирование TNF-α у мышей снижает колоректальный канцерогенез, связанный с хроническим колитом. J Clin Invest. (2008) 118: 560–70. DOI: 10.1172 / JCI32453

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

189. Хо АВИ, Вонг К.К., Лам С.К. Фактор некроза опухоли-альфа регулирует экспрессию CCL2 и молекул адгезии эпителиальных клеток проксимальных канальцев человека через сигнальные пути MAPK. Иммунобиология. (2008) 213: 533–44. DOI: 10.1016 / j.imbio.2008.01.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

190. Ахмад Р., Аль-Руб А., Кочумон С., Актер Н., Томас Р., Кумари М. и др. Синергизм между пальмитатом и TNF-α для продукции CCL2 зависит от пути TRIF / IRF3: последствия для метаболического воспаления. J Immunol. (2018) 200: 3599–611. DOI: 10.4049 / jimmunol.1701552

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

191.Кушинг С.Д., Берлинер Дж. А., Валенте А. Дж., Террито МС, Наваб М., Пархами Ф. и др. Минимально модифицированный липопротеин низкой плотности индуцирует хемотаксический белок 1 моноцитов в эндотелиальных клетках и гладкомышечных клетках человека. Proc Natl Acad Sci USA. (1990) 87: 5134–8. DOI: 10.1073 / pnas.87.13.5134

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

192. Rafei M, Hsieh J, Fortier S, Li M, Yuan S, Birman E, et al. CCL2, происходящий из мезенхимальных стромальных клеток, подавляет продукцию иммуноглобулинов плазматических клеток посредством инактивации STAT3 и индукции PAX5. Кровь. (2008) 112: 4991–8. DOI: 10.1182 / кровь-2008-07-166892

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

194. Smith LK, Boukhaled GM, Condotta SA, Mazouz S, Guthmiller JJ, Vijay R, et al. Интерлейкин-10 напрямую подавляет функцию CD8 + Т-клеток, усиливая разветвление N-гликанов для снижения чувствительности к антигену. Иммунитет. (2018) 48, 299–312.e5 doi: 10.1016 / j.immuni.2018.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

195.Грановский М., Фата Дж., Поулинг Дж., Мюллер В. Дж., Хоха Р., Деннис Дж. У. Подавление роста опухоли и метастазирования у мышей с дефицитом Mgat5. Nat Med. (2000) 6: 306–12. DOI: 10.1038 / 73163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

196. Ван Р, Лу М., Чжан Дж., Чен С., Ло Х, Цинь И и др. Повышенная экспрессия мРНК IL-10 в опухолево-ассоциированных макрофагах коррелировала с поздней стадией рака легких. J Exp Clin Cancer Res CR. (2011) 30:62. DOI: 10.1186 / 1756-9966-30-62

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

197. Эррени М., Мантовани А., Аллавена П. Макрофаги, связанные с опухолью (ТАМ) и воспаление при колоректальном раке. Cancer Microenviron. (2011) 4: 141–54. DOI: 10.1007 / s12307-010-0052-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

198. Herbeuval J-P, Lelievre E, Lambert C, Dy M, Genin, C. Рекрутирование STAT3 для продукции IL-10 клетками карциномы толстой кишки, индуцированной IL-6, полученным из макрофагов. J Immunol. (2004) 172: 4630–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.172.7.4630

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

199. Ван И, Ма Р., Лю Ф, Ли С.А., Чжан Л. Модуляция кишечной микробиоты: новая парадигма повышения эффективности терапии блокадой запрограммированной смерти-1 и запрограммированной смерти лигандом-1. Front Immunol. (2018) 9: 374. DOI: 10.3389 / fimmu.2018.00374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

200.Routy B, Le Chatelier E, Derosa L, Duong CPM, Alou MT, Daillère R и др. Микробиом кишечника влияет на эффективность иммунотерапии на основе PD-1 против эпителиальных опухолей. Наука. (2018) 359: 91–7. DOI: 10.1126 / science.aan3706

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хемогеномное профилирование для понимания противогрибкового действия биоактивного соединения аурона

Цитата: Alqahtani FM, Arivett BA, Taylor ZE, Handy ST, Farone AL, Farone MB (2019) Хемогеномное профилирование для понимания противогрибкового действия биоактивного аурона сложный.PLoS ONE 14 (12): e0226068. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068

Редактор: Шанкар Тангамани, Университет Среднего Запада, США

Поступила: 1 июля 2019 г .; Принята к печати: 18 ноября 2019 г .; Опубликовано: 11 декабря 2019 г.

Авторские права: © 2019 Alqahtani et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные о последовательностях общедоступны в NCBI SRA под регистрационным номером BioProject PRJNA4. Скрипты Perl доступны на GitHub по адресу https://github.com/fma3b/Barcode_Seq_Analysis. Все другие соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано Центром исследований ботанической медицины Теннесси и Программой молекулярных биологических наук в Государственном университете Среднего Теннесси.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Количество опасных для жизни грибковых инфекций растет из-за трудностей с диагностикой и лечением, которые ускоряют уровень смертности, связанной с грибковыми инфекциями, которая в настоящее время превышает смертность от малярии [1]. Candida albicans - наиболее часто выделяемый условно-патогенный грибковый патоген, вызывающий поверхностные инфекции слизистых оболочек или кандидоз полости рта и гениталий у людей, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом [2].У здоровых людей Candida spp. комменсалы слизистых оболочек гениталий, ротовой полости и желудочно-кишечного тракта. Однако с введением антибактериальных антибиотиков в качестве лечебной терапии в 1940-х годах было зарегистрировано постепенное увеличение числа случаев инвазивного кандидоза из-за связанной с антибиотиками потери бактериальной биоты и последующей колонизации Candida spp. на эпителиальных поверхностях, необходимое для патогенеза [3]. Несколько факторов риска способствуют патогенезу инвазивного кандидоза, включая трансплантацию органов, длительную госпитализацию в отделении интенсивной терапии, катетеризацию и интенсивное использование антибиотиков и иммунодепрессантов.Эти факторы могли привести к появлению Candida spp. колонизировать слизистые оболочки, что приводит к поверхностным инфекциям. Грибок также может перейти к кандидемии или вторжению в кровоток, а оттуда распространиться в разные органы. Определенные факторы вирулентности приписывают патогенности Candida spp., Включая адгезию к эпителиальным поверхностям, диморфный рост, образование биопленок и продукцию ферментов, повреждающих ткани [4, 5].

Для лечения кандидоза существует пять групп противогрибковых средств, определяемых по способу их действия и механизмы устойчивости к которым были описаны.Группа I: полиены (амфотерицин B) связываются с эргостерином в клеточной мембране и образуют в ней поры, тогда как группа II: эхинокандины (каспофунгин) ингибируют β (1,3) -глюкансинтазу в клеточной стенке. Группа III: азолы (флуконазол) ингибируют ланостерин 14 α-деметилазу в пути биосинтеза эргостерола. Группа IV: синтетические пиримидины (5-фторцитозин) ингибируют синтез ДНК и нарушают синтез белка, а группа V: аллиламины (тербинафин) ингибируют скваленэпоксидазу в пути биосинтеза эргостерина [6].Механизмы устойчивости к этим противогрибковым средствам были описаны как клеточные детерминанты, которые приводят к экструзии лекарственного средства посредством активного оттока, измененных мишеней лекарственного средства или сверхэкспрессии мишени лекарственного средства. Однако недавно сообщалось о новых механизмах устойчивости к лекарственным средствам как о надежных ответах, которые повышают толерантность к противогрибковым препаратам такими путями, как регуляция реакций на окислительный или термический стресс [7].

Даже при лечении коммерчески доступными противогрибковыми препаратами уровень смертности от диссеминированного кандидоза вырос до ~ 40–60%, что в 20 раз больше, чем всего два десятилетия назад [3].Ежегодно регистрируется более 250 000 случаев инвазивного кандидоза, 50 000 из которых умирают во всем мире [4]. Более того, только в США затраты на борьбу с кандидозом оценивались в 2–4 миллиарда долларов в год в 2000 г. [8]. Недавно сообщалось, что кандидоз занимает с третьего по четвертое место в мире по частоте инфекций, приобретаемых в результате медицинских мероприятий [9]. Хотя большинство случаев кандидоза у людей приписывается C . albicans , другие виды Candida не только появились в качестве возбудителей кандидоза, но также приобрели устойчивость к противогрибковым препаратам.К этим видам чаще всего относятся C . глабрата , С . tropicalis , C . парапсилоз и C . krusei [3]. Растущая популяция с подавленным иммунитетом, ограниченное количество основных противогрибковых агентов наряду с их резистентностью и проблемами токсичности, а также появление патогенных штаммов, отличных от albicans, - все это требует поиска альтернативных противогрибковых агентов с потенциально новыми мишенями.

Для достижения этой цели поиска альтернативных противогрибковых средств использование натуральных продуктов, особенно полученных из растений, представляется многообещающим источником для разработки противогрибковых соединений [10].Поскольку у растений есть свои собственные грибковые патогены, эти взаимодействия между растениями и грибами привели к возникновению различных химических соединений внутри растений, предназначенных не только для усиления их защиты от грибковых патогенов, но также их выживания и конкурентоспособности [11]. Одним из наиболее многообещающих классов натуральных продуктов являются вторичные метаболиты, ауроны, которые повсеместно присутствуют в растениях. Ауроны, или 2-бензилиденбензофуран-3- (2H) -оны, представляют собой структурные изомеры флавоноидов, которые естественным образом встречаются в растениях в виде пигментов желтого цвета [12–14].Помимо своей роли в пигментации, ауроны обладают множеством защитных функций в растении, включая антипитание насекомых [13], противопаразитарное [14] и противогрибковое действие [15, 16]. Кроме того, сообщалось об активности ауронов как противоопухолевых [16, 17], противопаразитарных [14], антилейшманических [18, 19] и противогрибковых агентов [20]. Поскольку биоактивные свойства и терапевтические перспективы природных и синтетических ауронов являются многообещающими, эти биоактивные соединения можно рассматривать как привлекательную основу для дизайна и разработки противогрибковых препаратов.

Ранее мы сообщали о синтезе и активности против Candida неприродных производных аурона, содержащих различные функциональные группы, включая аурон Sh2009 (рис. 1), которые проявляли значительное ингибирование C . albicans по сравнению с другими производными [21]. Сообщаемое нарушение образования биопленок с помощью аурона Sh2009 подчеркивает важность понимания механизма действия Sh2009. В настоящем исследовании была определена противогрибковая активность аурона Sh2009 в отношении различных стандартных и клинических Candida spp., включая устойчивые изоляты, применяя модифицированную стратегию синтеза, основанную на опосредованной кислотой конденсации между соответствующим бензофураноном и альдегидом. Способ противогрибкового действия аурона Sh2009 был охарактеризован с использованием хемогеномного подхода в коллекциях мутантов Saccharomyces cerevisiae и подтвержден в C . albicans SC5314.

Результаты

Aurone Sh2009 избирательно ингибирует

Candida spp.

Для оценки противогрибковой активности аурона Sh2009 против штаммов Candida (перечисленных в таблице S1) было проведено испытание на чувствительность к противогрибковым препаратам с использованием протокола микроразбавления бульона Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) [22].Sh2009 показал многообещающую противогрибковую активность против всех Candida spp. протестированы (таблица 1). С . albicans Все штаммы M2, M3, M5 и M7 устойчивы к флуконазолу и, как таковые, представляют серьезный риск для пациентов, поскольку флуконазол является основным противогрибковым препаратом для лечения кандидоза [2]. В этом исследовании флуконазол не оказывал ингибирующего действия на эти изоляты даже при высоких концентрациях (MIC> 64 мкг / мл), тогда как IC 50 аурона Sh2009 значительно ниже [11, 12, 4 и 8 мкМ) для . С . albicans штаммов M2, M3, M5 и M7 соответственно. Точно так же другой агрессивный изолят с множественной лекарственной устойчивостью, C . albicans ATCC 64124, проявлял устойчивость к высоким концентрациям амфотерицина B (16 мкг / мл), каспофунгина (4 мкг / мл) и флуконазола (64 мкг / мл), хотя 5-фторцитозин оказывал ингибирующее действие (MIC <1 мкг). / мл). Этот штамм также был чувствителен к Sh2009 (IC 50 = 21 мкМ). Хотя C . albicans излечивается как минимум в 50% случаев кандидоза, C . glabrata недавно стал причиной примерно 25% случаев за последние два десятилетия и имеет тенденцию инфицировать пожилые люди [23]. Экспозиция С . glabrata до Sh2009 приводило к ингибированию с низкой концентрацией аурона (IC 50 <3,125 мкМ), что позволяет предположить, что это может быть успешным лечением, особенно после разработки C . Сообщалось об устойчивости glabrata к каспофунгину и более низкой чувствительности к флуконазолу [24]. С . tropicalis , возбудитель 10–20% случаев кандидоза в США и 35–40% случаев в тропических регионах, также был восприимчив к Sh2009 [3]. Поскольку на аурон Sh2009 не влияют механизмы устойчивости этих изолятов с известной устойчивостью к противогрибковым препаратам, это соединение представляет новые возможности для дальнейшего изучения в качестве потенциального противогрибкового агента.

Таблица 1. Средние значения IC 50 (ингибирующая концентрация, вызывающая 50% -ное ингибирование) и MIC 90 (минимальная ингибирующая концентрация, вызывающая 90% -ное ингибирование) ± SEM аурона Sh2009 для различных Candida spp.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.t001

Хотя Sh2009 был ингибирующим, аурон не был фунгицидным даже при самой высокой тестируемой концентрации аурона (200 мкМ), о чем свидетельствует рост колоний на твердой среде. . Следовательно, для более точного измерения количества жизнеспособных клеток после обработки требовался более чувствительный анализ жизнеспособности клеток, совместимый с клетками дрожжей. Наряду с проточной цитометрией для количественной оценки жизнеспособности после обработки Sh2009 использовали набор живых / мертвых дрожжей Fungalight.После 48 ч обработки высокой концентрацией Sh2009 (200 мкМ), C . Штамм albicans SC5314 (рис. 2А) выявил две разделенные субпопуляции после стробирования окрашенных клеток на точечных графиках. По сравнению с клетками, обработанными изопропанолом (рис. 2B), значительная часть (рис. 2D) клеток, обработанных Sh2009, сгруппировалась в верхнем левом квадранте, что указывает на биоактивность Sh2009 в устранении C . albicans SC5314 рост. Напротив, количество жизнеспособных клеток в образце, обработанном Sh2009 (рис. 2A), уменьшилось примерно наполовину по сравнению с образцом необработанных клеток (рис. 2C).

Рис. 2. Анализ жизнеспособности клеток C , обработанного ауроном Sh2009. Альбиканс .

С . Суспензии клеток albicans SC5314 окрашивали красителем SYTO ® 9 (зеленая флуоресценция) и пропидия иодидом (красная флуоресценция) и анализировали с использованием проточного цитометра Millipore Guava и системы программного обеспечения InCyte. Для каждой точечной диаграммы A) 200 мкМ клеток, обработанных ауроном Sh2009, B) убитых изопропанолом клеток и C) необработанных клеток, верхний левый квадрант показывает количество мертвых клеток и верхний правый квадрант показать количество живых клеток. D) Значимость рассчитывали с использованием двустороннего дисперсионного анализа для сравнения жизнеспособности клеток двух популяционных групп (живых и мертвых) между необработанными и обработанными Sh2009 клетками. P значений (**** P ≤ 0,0001), (** P ≤ 0,01). (n = 3 ± SD).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g002

Рост обработанных Sh2009 C . albicans SC5314 контролировали с 30-минутными интервалами в течение 46-часовой инкубации с использованием разведений аурона.Представительный набор кривых роста C . albicans SC5314 приведен на фиг. 3A. Кривые указывают на отсутствие повторного роста C . albicans SC5314 в присутствии Sh2009 выше 12,5 мкМ. Дополнительно ингибирование C . albicans SC5314 от Sh2009 сильно зависит от дозы. Эффективность любого биоактивного соединения обычно измеряется концентрацией соединения, которое ингибирует 50% (IC 50 ) фиксированного патогенного инокулята в тесте доза-ответ in vitro .Однако наклон кривой доза-ответ - еще один клинически независимый критерий, который можно использовать в качестве индикатора ожидаемой терапевтической эффективности [25]. Обычно кривая доза-ответ с особенно крутым наклоном (коэффициент Хилла> 1) указывает на то, что небольшое увеличение концентрации лекарственного средства выше IC 50 вызывает чрезвычайно высокий уровень ингибирования. Sh2009 показал более крутую кривую зависимости IC 50 от дозы при ингибировании C . albicans SC5314, на что указывает более высокий коэффициент наклона (~ 2.241) (рис. 3В). Крутой наклон кривой IC 50 отражает результаты кривой роста для обработанных клеток, поскольку наблюдается значительная потеря жизнеспособности при концентрациях аурона выше концентрации IC 50 , составляющей 16,28 мкМ. Это предсказывает возможную терапевтическую эффективность Sh2009 с селективной 50% ингибирующей концентрацией, необходимой для ингибирования C . albicans клеток SC5314 (0,5–2,5 × 10 3 КОЕ / мл).

Рис. 3. Аурон Sh2009 проявлял дозозависимое ингибирование роста.

A) Кривые роста C . albicans Штамм SC5314 (2,5–0,5 × 10 3 КОЕ / мл) в разведениях Sh2009 (3,125–200 мкМ) в среде RPMI-1640 с использованием прибора кривой роста Bioscreen C для измерения OD 530 каждые 30 мин в течение 46 часов при 35 ° C. B) Построение графика нелинейной регрессии показаний OD 530 с использованием программного обеспечения GraphPad для расчета значения IC 50 после преобразования молярных концентраций аурона Sh2009 в логарифмическую форму. C) График тайм-килла C . albicans Клетки SC5314 (0,5–0,25 × 10 5 КОЕ / мл), обработанные в концентрациях, в пять раз превышающих IC 50 концентраций Sh2009 (16,28 мкМ), флуконазола (0,5 мкг / мл) и амфотерицина B ( 0,25 мкг / мл) с инкубацией при 35 ° C в указанные моменты времени. Колониеобразующие единицы (КОЕ) определяли путем посева 10 мкл каждой обработки на чашки с агаром YPD в каждый момент времени. D) Цитотоксические эффекты аурона Sh2009 для C . albicans SC5314 и линии клеток человека THP-1, HepG2 и A549 представлены в виде кривых доза-ответ путем построения графика нелинейной регрессии жизнеспособности клеток с использованием программного обеспечения GraphPad для расчета значений CC 50 после преобразования молярных концентраций аурон Ш2009 в логарифмической форме.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g003

Для исследования кинетики уничтожения аурона Sh2009 против C использовали метод «time-kill». albicans SC5314 вместе с лечением флуконазолом и амфотерицином B (рис. 3C). Как и ожидалось, амфотерицин B влиял на кривую роста при 8 мкг / мл через 2 часа, независимо от исходного инокулята C . albicans клеток SC5314 (0,5–0,25 × 10 5 КОЕ / мл), демонстрирующих фунгицидную активность. Обработка Sh2009 в концентрации, представляющей приблизительное пятикратное увеличение IC 50 , рассчитанного из серии двукратных разведений (500 мкМ), уменьшала рост дрожжей аналогично флуконазолу (16 мкг / мл) без значительных различий. до 12 часов инкубации, что указывает на фунгистатическую активность.Учитывая исходный посевной материал, обработка Sh2009 приводила к снижению приблизительно> 3 log 10 КОЕ / мл после каждой временной точки обработки по сравнению с необработанной культурой, демонстрируя значительное снижение (значение P ≤0,0001) в количестве колоний. Это снижение КОЕ / мл не привело к заметному увеличению скорости роста после обработки Sh2009 в течение 24 часов, тогда как в необработанной культуре было зарегистрировано> 4,4 log 10 значительного увеличения КОЕ / мл между 0 и 24 часами.Эти результаты указывают на фунгистатическую активность, которая может быть менее желательной для пациентов с ослабленным иммунитетом для лечения оппортунистических инфекций. Следовательно, мы измерили цитотоксичность Sh2009 для трех различных линий клеток человека.

Анализы токсичности для определения цитотоксической концентрации аурона, которая снижает жизнеспособность клеток на 50% (CC 50 ), проводились на основе восстановления резазурина до резоруфина метаболически активными клетками в качестве чувствительного метода обнаружения жизнеспособных клеток [26].Значения CC 50 для клеток THP-1, HepG2, A549 после 24-часовой обработки двукратными серийными разведениями Sh2009 (3,125–200 мкМ) составляли 140, 168 и> 200 мкМ соответственно (таблица 2). Значения индекса селективности (SI) были рассчитаны для корреляции противогрибковой активности аурона Sh2009 с C . albicans клеток SC5314 (IC 50 16,28 мкМ) с концентрацией CC 50 для линий клеток человека. Отношение CC 50 / IC 50 составляло ~ 8.6-> 12-кратная разница в концентрациях, приводящая к потере жизнеспособности клеток на 50%, что свидетельствует о селективности Sh2009 в отношении патогенных дрожжевых клеток по сравнению с человеческими клетками. Лечение C . albicans SC5314 клетки с Sh2009 в концентрации 25 мкМ приводили к значительному снижению ( P ≤ 0,001) жизнеспособности клеток по сравнению с необработанной контрольной группой, в то время как обработка линий клеток человека той же концентрацией не приводила к заметному снижению жизнеспособности клеток. 70% жизнеспособности клеток THP-1 и 100% жизнеспособности клеток HepG2 и A549.При увеличении концентрации Sh2009 жизнеспособность клеток C . albicans SC5314 был значительно снижен ( P ≤ 0,01) по сравнению с жизнеспособностью клеток человека (рис. 3D). Эти результаты показывают, что аурон Sh2009 обладает избирательной токсичностью в отношении клеток C. albicans . Чтобы помочь в оценке терапевтического потенциала аурона Sh2009 как противогрибкового средства, мы затем попытались определить биоактивность соединения путем определения режима его токсичности.

Таблица 2.CC 50 (концентрация цитотоксичности аурона Sh2009, которая вызывает 50% потерю жизнеспособности клеток) ± SEM и индекс селективности (SI) как соотношение между CC 50 для клеток млекопитающих, деленным на IC 50 против С . albicans SC5314.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.t002

Хемогеномное профилирование дрожжевых клеток, обработанных ауроном Sh2009, позволяет определить роли генов, участвующих в клеточном цикле, делении клеток и актиновом цитоскелете

Хемогеномное профилирование использовалось для характеристики механизма действия аурона Sh2009.Профилирование гаплонедостаточности (HIP) и гомозиготное профилирование (HOP) позволяют проводить параллельную оценку чувствительности и устойчивости объединенного полногеномного набора S . cerevisiae. Делеционные мутанты . Сначала два пула S . cerevisiae Коллекции гетерозиготных (HIP) и гомозиготных (HOP) мутантов с делецией обрабатывали ауроном Sh2009 в концентрации (~ 500 мкМ), которая подавляла рост S дикого типа. cerevisiae -S288C (1.25 × 10 9 клеток / мл) на 20% в течение 48 часов. После очистки геномной ДНК от мутантов, синтетические штрих-коды ДНК UPTAG (20 п.н.) были амплифицированы с использованием уникально проиндексированных праймеров для различения каждого образца. Поскольку каждый мутант однозначно идентифицируется с помощью штрих-кода ДНК, для количественной оценки численности каждого мутанта использовалось мультиплексное секвенирование следующего поколения как очень надежный метод.

Профилирование гаплонедостаточности было выполнено на ~ 1056 гетерозиготных мутантах, которые необходимы для роста и экспрессируют только 50% дозы гена, потому что одна функциональная копия этого конкретного гена в диплоидном организме была удалена.Таким образом, идентификация прямой мишени определенного биологически активного соединения может быть идентифицирована в присутствии этого соединения как мутанта, который имеет большой дефект приспособленности по сравнению с другими мутантами, которые не кодируют мишень лекарственного средства. Напротив, гомозиготное профилирование было выполнено на ~ 4244 гомозиготных мутантах, которые не являются необходимыми для роста и экспрессируют 0% дозы гена, потому что обе копии конкретного гена удалены в диплоидном организме. С помощью анализа HOP можно подавить чувствительность к лекарственным средствам из-за полных аллелей потери функции, что позволяет идентифицировать пути, которые придают чувствительность к лекарствам или идентифицировать прямую мишень лекарств, следуя принципу, что удаление мишени лекарственного средства приведет к клетки нечувствительны к соединению [27].

Анализ данных после секвенирования делеционных мутантов, обработанных ауроном, выявил 3923 мутанта, в том числе 3133 мутанта из пула гомозиготных делеций (несущественные гены) и 790 мутантов из пула гетерозиготных делеций (основные гены), что составляет ~ 75%. мутантной популяции с используемыми счетчиками считываний и корреляцией 0,90 между образцами, что указывает на высокое качество образца и согласие. Химико-генетическое взаимодействие положительного контроля метилметансульфоната (MMS), хорошо охарактеризованного противогрибкового агента, повреждающего ДНК [28], продемонстрировало очень значительное обогащение (значение P ≤ 0.001) для клеточного ответа на стимул повреждения ДНК, подтверждая успешную процедуру анализа HIP-HOP и точный анализ данных после секвенирования. В результате химико-генетического взаимодействия было идентифицировано 238 мутантов с делецией гена, которые в значительной степени реагировали на аурон Sh2009 (значения FDR P ≤ 0,05) для обоих профилей HIP-HOP (рис. 4A и 4B). Чувствительные и устойчивые гены с этим значением P (примерно ≥ 1,5-кратное изменение) для HIP и HOP независимо использовались для анализа обогащения онтологии генов (GO) с использованием ClueGO [29] и Yeast Gene Ontology Slim Term Mapper по адресу Saccharomyces Genome База данных (SGD) [30].

Рис. 4. Химико-геномный анализ аурона Sh2009.

A) Z-оценка пула гетерозиготных делеций (профиль HIP) для основных генов и B) Z-оценка пула гомозиготных делеций (HOP-профиль) для несущественных генов, в которых чувствительные мутанты имеют положительный результат. оценки, а устойчивые мутанты - отрицательные. C) и D) Число мутантов, чувствительность или резистентность которых были затронуты ауроном Sh2009 (FDR P ≤ 0.05, кратное изменение ≥ 1,5) сгруппированы по значимым биологическим ответам и представлены на диаграмме Венна для профилей HIP и HOP соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g004

Для основных генов (профиль HIP) было обнаружено обогащение GO ( P ≤ 0,0001) для мутантов, у которых были удалены гены, кодирующие белки клеточного цикла (например, CDC28 Δ, CDC34 Δ, CDC25 Δ, CDC13 Δ, ORC4 Δ, MCM2 Δ, MCM7 Δ, CBK1 ΔC, и CBK1 ΔC, и .Более того, два других биологических ответа, вовлеченных в клеточный цикл, показали значительное обогащение ГО ( P ≤ 0,01). К ним относятся гены мейозных дрожжей ( ORC4 Δ, MCM2 Δ, MCM7 Δ, APC4 Δ, APC1 Δ, CDC28 Δ и CDC5 Δ репликации). Δ, MCM2 Δ, MCM7 Δ, RFC3 Δ и RFC1 Δ). Для несущественных генов (профиль HOP) среди чувствительных и устойчивых мутантов обогащение GO ( P ≤ 0.01) обнаружены чувствительные мутанты ( ARK1 Δ, NIP100 Δ, GIC1 Δ, SLK19 Δ, KIP3 Δ и ACF4 Δ) и устойчивые мутанты ( BOΔI2 Δ , END3 Δ и GIC2 Δ) с удаленными генами, которые связаны с организацией актинового цитоскелета (фиг. 3D). Кроме того, мутанты, которые связаны с делением клеток, были значительно обогащены профилем HOP ( LDB19 Δ, SLK19 Δ, LTE1 Δ, ZIP2 Δ, BUB1 Δ, ELM1 F1 TO, TO Δ, TOF2 Δ, SWI4 Δ, CSM3 Δ, CLB3 Δ и CLN2 Δ).Наконец, произошло обогащение делеционных мутантов биологического ответа эндоцитоза, который также относится к актиновому цитоскелету, включая мутанты, входящие в первую 10-ю чувствительность в профиле HOP ( FEN2 Δ, LTE1 Δ, LDB19 Δ и ARK1 Δ) (таблицы S2 и S3).

Для нескольких фенотипов, описанных выше, путь клеточного цикла оказался основным путем-мишенью, который был значительно обогащен обработкой Sh2009 для профиля основных генов и профиля второстепенных генов по отдельности.Чтобы получить более широкое представление об изменениях в моделях роста гетерозиготных и гомозиготных мутантов после обработки Sh2009, мутанты с высокой степенью реакции из обоих профилей HIP-HOP были объединены и использованы для анализа обогащения. Для всех 238 генов, кодирующих удаленный белок с (значения FDR P ≤ 0,05 и кратное изменение ≥ 1,5) из обоих профилей, кластерный анализ путей KEGG и терминов генной онтологии, которые значительно обогатились (значения FDR P ≤ 0,05), были нанесены на график для количество генов, связанных с каждым термином на гистограмме (рис. 5).Примечательно, что оба профиля для 80 основных генов (профиль HIP) и 158 несущественных генов (профиль HOP) в значительной степени сгруппированы для наиболее значительно обогащенной категории (таблица S4). Эти в значительной степени чувствительные гены были сопоставлены с шестью путями в базе данных путей KEGG, причем путь клеточного цикла был наиболее значительно обогащенным путем ( P ≤ 0,0001) наряду с другими путями, которые полностью перекрывались с путями клеточного цикла (мейоз и репликация ДНК. ). Для категорий генной онтологии в рамках категории биологических процессов 18 терминов были обогащены дифференциально чувствительными или устойчивыми мутантами, включая деление клеток, организацию цитоскелета и регуляцию эндоцитоза.Кроме того, термины связывания нуклеотидов, аминоацил-тРНК-лигазы и условия связывания ДНК были значительно обогащены в категории молекулярных функций. Ядро, цитоскелет, клеточный зачаток, а также участок поляризованных условий роста были значительно обогащены в категории клеточных компонентов.

Рис. 5. Обогащенный анализ функциональных категорий пути KEGG и генной онтологии (биологический процесс, молекулярная функция и клеточный компонент) 238 дифференциально чувствительных мутантов с FDR ≤ 0.05 и кратность изменения ≥ 1,5 из профилей пула гетерозиготных делеций (HIP) и пула гомозиготных делеций (HOP).

Фиолетовые столбики представляют количество генов, 80 основных генов из HIP-профиля и 158 несущественных генов из HOP-профиля, которые сгруппированы в каждом члене KEGG / GO. Зеленые полосы показывают значимость каждой категории в виде значений log P , которые вычисляются гипергеометрическим расчетом с помощью программного обеспечения ClueGo с использованием категорий GO в Saccharomyces cerevisiae -S288C в качестве фона с FRD ≤ 0.05 как значимое значение отсечки для всех нанесенных на график категорий. Пунктирной линией показаны наиболее значимые категории KEGG / GO с P ≤ 0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g005

Чтобы получить представление о химико-генетическом взаимодействии генов, нацеленных на аурон Sh2009, и визуализировать связи между целевыми биологическими ответами и путями, идентифицированными как Профили HIP и HOP, ClueGO и CluePedia вместе с программным обеспечением Cytoscape были использованы для извлечения и картирования неизбыточных биологических ответов для большого набора функционально сгруппированных генов с использованием терминов GO и пути KEGG одновременно [29, 31].На рис. 6А изображена функциональная сеть аннотаций сгруппированных основных и второстепенных генов. Эта перекрывающаяся сеть выявила относительно связанные биологические категории, которые начинались от наиболее значимо обогащенного пути (клеточный цикл) до менее значимых путей (мейоз, репликация ДНК, эндоцитоз и биогенез РНК). Если сосредоточить внимание только на пути клеточного цикла (рис. 6В), несущественные гены (профиль HOP) были сильно сгруппированы с основными генами (профиль HIP) для значительно обогащенных биологических процессов, связанных с организацией актинового цитоскелета и эндоцитозом.Восемь кластерных генов актинового цитоскелета и эндоцитоза были обнаружены среди 20 самых чувствительных мутантов как профилей HIP, так и HOP, что указывает на зависимую от клеточного цикла организацию актинового цитоскелета и эндоцитоз как мишени для аурона Sh2009. Кроме того, наиболее значительно обогащенной молекулярной функцией для чувствительных к Sh2009 мутантов был нуклеотид-связывающий белок. Сеть аннотаций выявила 51 нуклеотид-связывающий белок, который достоверно реагировал на аурон Sh2009; 31 из этих генов кодирует белки, которые действуют как АТФ-связывающие белки, а остальные 10 кодируют GTP-связывающие белки.Взятые вместе, анализ функционального обогащения пула делеций основных и второстепенных генов показывает, что лечение ауроном Sh2009 может нацеливаться на нуклеотидсвязывающие белки, что приводит к ряду клеточных дефектов, которые принадлежат пути клеточного цикла, организации актинового цитоскелета и эндоцитозу.

Рис. 6. Интерактивно функциональная сеть аннотаций 238 дифференциально реагирующих мутантов.

A) Функционально сгруппированная сеть терминов пути KEGG и генной онтологии, которые представлены в виде узлов и связаны друг с другом на основе сходства связанных с ними генов с использованием приложения ClueGo вместе с программным обеспечением Cytoscape. B) Увеличение самого высокого значимого узла выявило наиболее значимый узел как путь клеточного цикла ( P ≤ 0,001). Квадратный узел представляет путь KEGG, узлы круга представляют биологические процессы, а узлы треугольника представляют молекулярную функцию, в то время как цвета обозначают сгруппированные гены, связанные с биологической категорией, а размер узла представляет значения P (0,05 в качестве порогового значения). . Приложение CluePedia показывает гены для каждого узла, где толщина краев отражает код свидетельства GO (жирная линия основана на экспериментальных данных, а тонкая линия выводится из электронной аннотации).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g006

Перед оценкой биологических ответов на аурон использовали кривые роста для подтверждения чувствительности или устойчивости ответов отдельных мутантов к Sh2009 [32]. Двенадцать мутантов, которые имели более чем двукратное изменение и также участвовали в предполагаемых биологических ответах как из профилей HIP, так и HOP, были протестированы индивидуально с использованием разведений Sh2009 (3,125–200 мкМ). Различия в логарифмической фазе роста между S дикого типа.Сравнивали cerevisiae -S288C и мутанты, обработанные Sh2009. Фиг.7 и S1 Фиг.8 изображают кривые роста индивидуума S . cerevisiae делеционные мутанты для подтверждения моделей роста профилей HIP и HOP.

Рис. 7. Кривые роста обработанного Sh2009 S . cerevisiae -S288C и мутанты подтверждают химико-генетическое взаимодействие.

A) и B) Кривые роста гетерозиготных мутантов (HIP) и гомозиготных мутантов (HOP), соответственно, по сравнению с диким типом S . cerevisiae -S288C при IC 50 концентрация обработки ауроном Sh2009 (16 мкМ) в бульоне YPD с использованием прибора кривой роста Bioscreen C и считывание OD 600 с 30-минутными интервалами в течение 25 часов во время инкубации при 30 ° С. C) Индивидуальные сравнения значимости роста каждого мутанта и дикого типа S . cerevisiae -S288C во время экспоненциальной фазы в IC 50 концентрация аурона Sh2009 представлена ​​как среднее значение ± стандартная ошибка среднего с использованием теста множественных сравнений Даннета для гетерозиготных и гомозиготных мутантов. P значений (* P ≤ 0,05) (** P ≤ 0,001) (*** P ≤ 0,0001).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g007

Индивидуальные гетерозиготные чувствительные штаммы TSC11 Δ, YPP1 Δ, CDC42 Δ, CDC25 Δ, ΔC28 и RSP5, Δ из химико-генетического профилирования, все показали снижение роста при обработке Sh2009 по сравнению с ростом в логарифмической фазе S . cerevisiae -S288C дикого типа, что подтверждает результаты химико-генетического анализа взаимодействия (фиг. 7A). Для гомозиготных мутантных штаммов такие же клеточные эффекты наблюдались при снижении роста чувствительных мутантов ( LTE1 Δ, FEN2 Δ и ARK1 Δ) и повышенном росте устойчивых мутантов ( CLN2 Δ, LIN1 Δ и ZIP2 Δ) в присутствии Sh2009 по сравнению с S дикого типа. cerevisiae -S288C (фиг. 7B).Кроме того, рост каждого мутанта в концентрации IC 50 Sh2009 (16 мкМ) сравнивали независимо с ростом S . cerevisiae -S288C для оценки значимых различий между ростом каждого мутанта и дикого типа. Все мутанты продемонстрировали существенные отличия в росте от дикого типа ( P ≤ 0,05–0,0001), что подтвердило их ожидаемые модели роста как чувствительных или устойчивых мутантов к аурону Sh2009 и подтвердило результаты анализа обогащения, поскольку эти мутанты несут делеции генов ассоциированный с прогрессированием клеточного цикла ( CDC25 Δ, CDC28 Δ, CLN2 Δ, LIN1 Δ и ZIP2 Δ), организация актинового цитоскелета ( TSC11 Δ, CDC42 Δ Δ, LTE1 Δ и ARK1 Δ) и эндоцитоз ( TSC11 Δ, YPP1 Δ, FEN2 Δ и RSP5 Δ) (рис. 7C).Однажды мы подтвердили закономерности роста особи S . cerevisiae, мутантов к аурону Sh2009, C . albicans обрабатывали ауроном для выявления фенотипических изменений, связанных с предполагаемыми биологическими ответами патогена.

Aurone Sh2009 блокирует развитие клеточного цикла у

Candida albicans

Клеточный цикл был наиболее значительно обогащенным путем в химико-генетическом анализе взаимодействия (рис. 5 и 6).Другие обогащенные пути, мейоз и репликация ДНК, также вносят вклад в путь клеточного цикла. Соответственно, если аурон Sh2009 нацелен на белки, кодируемые генами клеточного цикла, распределение фаз клеточного цикла в популяции грибковых клеток во время экспоненциальной фазы должно быть изменено по сравнению с нормальным распределением, что указывает на остановку клеточного цикла. Для этих экспериментов изменения в содержании ДНК на разных фазах клеточного цикла оценивались с помощью проточной цитометрии, которая позволяет количественно определять отдельные клетки.Мечение клеточной ДНК йодидом пропидия (PI) позволяет количественно различать клетки в различных фазах клеточного цикла на основе интенсивности флуоресценции, которая пропорциональна конкретной фазе клеточного цикла [33]. Поскольку клетки фазы G1 имеют единственную копию генома, таким образом, имея наименьшее количество ДНК, тогда как клетки фазы S активно участвуют в репликации ДНК и будут иметь повышенное количество ДНК, а клетки G2 / M имеют в два раза больше ядерной ДНК Клетки в фазе G1, проточно-цитометрический анализ ядер, окрашенных йодидом пропидия, может эффективно дифференцировать популяции G0 / G1, S и G2 / M.

Перед лечением C . albicans SC5314 клеток с Sh2009 или цитохалазином D (CytoD) в качестве положительного контроля для остановки клеточного цикла, образец ранней экспоненциальной культуры собирали и обрабатывали, как описано в материалах и методах, для обеспечения активного роста клеток. Гистограмма на Фиг.8А. указывает на быстро делящуюся культуру, имеющую значительную долю клеток (~ 70%) в S-фазе. Гистограмма показывает оптимальное распределение проточной цитометрии для активно растущей культуры дрожжей в богатой среде во время ранней экспоненциальной фазы и соответствует предыдущим наблюдениям [33, 34].После дополнительных 3 ч инкубации без обработки необработанный C . albicans Клетки SC5314 все еще делились с примерно одинаковыми фазами распределения клеточного цикла до трех дополнительных часов инкубации (фиг. 8B). Однако, в отличие от прогрессии клеточного цикла в необработанных образцах, распределение клеточного цикла для C . Клетки albicans SC5314, которые инкубировали в течение 3 часов с концентрацией Sh2009 IC 50 , были явно нарушены (рис. 8C).Наблюдалось значительное снижение доли клеток в фазе S (46,88% по сравнению с 70% в необработанных клетках, P ≤ 0,001) и значительное увеличение доли клеток в фазе G1 (46% по сравнению с 16,53%). %, P ≤ 0,0001), что указывает на накопление клеток в фазе G1 (рис. 8E). Как и ожидалось, 3 часа лечения CytoD, противоопухолевым препаратом, который ингибирует сборку и разборку субъединиц актина, привели к задержке прогрессирования фазы G1 [35]. Гистограмма ДНК выявила меньше клеток в фазе S и больше в фазе G1 (52.68%, 39,17,0% и 2,13% в фазах G0 / G1, S и G2 / M соответственно) (рис. 8D).

Рис. 8. Проточно-цитометрический анализ эффектов аурона Sh2009 на развитие клеточного цикла в C . albicans SC5314.

Гистограммы ДНК, показывающие процентное содержание клеток в фазе G0 / G1 (розовый пик слева), фазе S (зеленый центральный пик) и фазе G2 / M (синий пик справа) в процентах от общего количества клеток, которые были окрашены йодидом пропидия (красная флуоресценция) и проанализированы с использованием проточного цитометра Millipore Guava и системы программного обеспечения Guava PCA-96.A) Необработанные клетки в момент 0 времени, B) необработанные клетки через 3 часа дополнительной инкубации, C) клетки, обработанные ауроном Sh2009, после 3 часов обработки IC 50 в концентрации Sh2009 (16 мкМ) и D) CytoD- обработанные клетки после 3 ч обработки (25 мкМ) в качестве положительного контроля. E) Сравнение значимости, P значений (**** P ≤ 0,0001), (*** P ≤ 0,001), (** P ≤ 0,01) из двухфакторного дисперсионного анализа используется для сравнения трех популяционных групп фаз G0 / G1, S и G2 / M между необработанными клетками и клетками, обработанными Sh2009.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g008

Накопление обработанных Sh2009 клеток в фазе G1 означает, что аурон Sh2009 останавливает развитие клеточного цикла, поддерживая результаты химико-генетического взаимодействия, в которых наиболее значимо мутанты, чувствительные к Sh2009, по существу обладают делециями белков, кодирующих клеточный цикл. Химико-генетический анализ показал, что гомозиготный делеционный штамм CLN2 Δ, в котором отсутствует ген циклина G1, был устойчив к Sh2009 (рис. 7B), а гетерозиготный делеционный штамм CDC28 Δ, циклин-зависимая киназа (CDK), был чувствительным. к Sh2009 (рис. 7A).В S . cerevisiae , циклин Cln2 активирует CdcC28 в поздней фазе G1, приводя к регуляции поляризации актинового цитоскелета, которая является критической для появления зачатков и перехода фазы G1 в S во время прогрессии клеточного цикла [36]. Следовательно, мы затем попытались определить, влияет ли аурон Sh2009 на нарушение актинового цитоскелета.

Aurone Sh2009 возмущает динамику актинового цитоскелета в

C . albicans

Химико-генетический анализ взаимодействия показал, что зависимая от клеточного цикла организация актинового цитоскелета и эндоцитоз являются мишенями для аурона Sh2009 из-за очень значительного нарушения роста 18 гетерозиготных и гомозиготных мутантов с делецией, отмеченных как вовлеченные в организацию актинового цитоскелета и эндоцитоз (рис. 6Б).Флуоресцентное окрашивание актина и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия были использованы для визуализации эффектов Sh2009 на поляризацию актинового цитоскелета. Sh2009-обработанный и необработанный C . albicans клеток SC5314 вместе с S . cerevisiae CDC42 Δ гетерозиготный штамм с делецией актин-регуляторного гена исследовали под микроскопом на фенотипы, указывающие на нарушение распределения актина. В поздней фазе G1 клеточного цикла почкующихся дрожжей актиновые пятна обычно должны собираться на кончике небольшой растущей почки с прозрачными актиновыми кабелями, которые поляризованы от кончика почки к материнской клетке.Кабели актина служат дорожками для транспортировки мРНК, белков, митохондрий и рибосом от материнской клетки к дочерней клетке. Актиновые пятна сгруппированы в участках секреции и эндоцитоза, выполняя критическую роль в инвагинации плазматической мембраны во время эндоцитоза [37] и ремоделирования клеточной стенки посредством ориентации поляризованной секреции компонентов клеточной стенки и ферментов на актиновые пятна, способствуя появлению зачатков [38, 39]. .

Изображения на фиг. 9 отображают типичную поляризацию актина для необработанного C . albicans SC5314 клетки во время экспоненциальной фазы, в которой ~ 76,47% клеток наблюдались с красными флуоресцентными пятнами актина, сконцентрированными в почках вместе с ростом поляризованных апикальных клеток. Однако после 3 ч обработки Sh2009, C . albicans Клетки выглядели аномально круглыми и увеличенными по сравнению с необработанными клетками, что указывало на деполяризованный рост (фиг.9, панель DIC). Кроме того, только ~ 34,17% обработанных Sh2009 клеток сохраняли актиновые пятна в зачатках, тогда как остальные имели актиновые пятна, которые были случайным образом разбросаны как в материнской клетке, так и в почках, что указывает на деполяризацию актина.Кроме того, обработанные Sh2009 клетки обнаруживают отчетливо искаженную сборку актина, приводящую к значительному количеству крупных агрегатов актина (Рис. 9, панель Actin). Этот фенотип ранее был связан с эндоцитарными мутантами, такими как, но не ограничиваясь ими, ARK1 Δ [40], END3 Δ [41] и RPS5 Δ [42]. В исследованиях кривой роста с индивидуально обработанными делеционными мутантами Sh2009 эти штаммы были либо чувствительными ( ARK1 Δ и RPS5 Δ), либо устойчивыми ( END3 Δ) к Sh2009 (рис. 7A и 7B), а также были идентифицированы в нашем исследовании. анализ химико-генетического взаимодействия (рис. 6Б).Предыдущее исследование, в котором изучали состав скоплений актина с помощью иммуно-электронной микроскопии, обнаружило накопление эндоцитарных везикул, окруженных актиновыми филаментами и смесью актиновых пятен и эндоцитарных белков, что свидетельствует о неспособности созреть эндоцитарные везикулы должным образом в результате неспособность разобрать актин-ассоциированные эндоцитарные комплексы [43].

Распределение актина в S . Мутант с делецией cerevisiae CDC42 также был исследован из-за его чувствительности к Sh2009 (фиг. 7A).В большинстве S . cerevisiae CDC42 Δ мутантных клеток, наблюдалось накопление больших, круглых, не покрытых почками клеток с распределенными актиновыми пятнами (рис. 9, панель DIC), что подтверждает предыдущие сообщения [36]. Деполяризованный рост, а также аномальное распределение актиновых пятен у обработанного Sh2009 C . albicans Клетки поддерживают ингибирование остановки клеточного цикла, предотвращая прогрессирование фазы G1 (рис. 8D). В клетках дрожжей в нескольких исследованиях было доказано, что неудача в перестройке актиновых пятен на участке зачатка в фазе G1 предотвращает появление зачатка и останавливает клеточный цикл в фазе G1 [44, 45].Эти находки совместимы с предыдущими наблюдениями, которые установили определенную связь между организацией интактного актинового цитоскелета и прогрессированием клеточного цикла [35].

Рис. 9. Динамика актинового цитоскелета в дрожжевых клетках, обработанных ауроном Sh2009.

С . albicans SC5314 и S . cerevisiae CDC42 Δ мутантные клетки фиксировали, и актин окрашивали красным флуоресцентным фаллоидином родамина (RP), а ядерную ДНК окрашивали синим флуоресцентным DAPI.Масштабная линейка = 5 мкм. Количественные данные представляют процент клеток, которые сохранили поляризованный актиновый цитоскелет, при сравнении между обработанным ауроном Sh2009 и необработанным C . albicans клеток SC5314. Среднее значение ± SEM (значение P ≤0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g009

Aurone Sh2009 заменяет

C . albicans Экспрессия генов, вовлеченных в клеточный цикл, поляризацию актина и эндоцитоз

Для изучения изменений экспрессии генов в ответ на аурон Sh2009 была использована количественная ПЦР с обратной транскрипцией, чтобы подтвердить изобилие мРНК набора C . albicans SC5314 гены, гомологичные S . cerevisiae гены -S288C в гетерозиготных и гомозиготных мутантах с делециями, идентифицированные как значительно обогащенные по путям из анализа химико-генетического взаимодействия (фиг. 5). Гены, связанные с клеточным циклом, были наиболее чувствительны к аурону Sh2009. Успешное развитие клеточного цикла требует экспрессии генов контрольных точек, которые гарантируют последовательное выполнение определенных клеточных процессов. Например, перед сегрегацией хромосом сначала должна быть реплицирована хромосомная ДНК.Эти процессы упорядочиваются активацией и инактивацией (CDK) Cdc28, АТФ-связывающего белка, который объединяется с активирующими субъединицами, называемыми циклинами [44]. HGC1 , это C . albicans, ген , гомологичный S . cerevisiae Ген циклина G1 CLN2 , кодирующий циклин G1, который связывается с Cdc28 с образованием комплекса циклин-CDK, играющего центральную роль в переходе G1 / S во время клеточного цикла [46, 47]. Ш2009-обработанный С . albicans SC5314 дает ~ 2.3 и 4,9-кратное соответственно подавление экспрессии гена CDC28, и HGC1 после 1,5 ч обработки (фиг. 10), подтверждая роль Sh2009 в аресте C . albicans клеточный цикл в фазе G1 (рис. 8C).

Фиг.10. Экспрессия генов в ауроне Sh2009, обработанном C . albicans SC5314.

Относительную генную экспрессию нормализованных уровней транскриптов обработанных образцов рассчитывали путем сравнения с нормализованными уровнями транскриптов необработанных образцов ( 2 -ΔΔCt ) для генов, связанных с клеточным циклом и актиновым цитоскелетом, в указанные моменты времени лечение.Данные представляют собой средние значения для двух биологических повторов, каждая из которых имеет три технических повтора. Кратность изменений ≥ 1,8 при значениях P ≤ 0,05 (* P ≤ 0,05), (** P ≤ 0,001), (*** P ≤ 0,0001) считались значимыми для повышения регуляции (положительный баллов) или подавление (отрицательные баллы).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226068.g010

Связывание Cdc28 с Hgc1 является важным регуляторным этапом для контроля развития клеточного цикла.Этот комплекс регулирует полярность путем фосфорилирования и блокирования Rga2 (негативный регулятор Cdc42), таким образом активируя Cdc42 (GTP-связывающий белок), что приводит к устойчивой поляризации актина и росту гиф [48]. Неудача в перемещении Cdc42 с помощью комплекса Cdc28-Hgc1 либо в сайт зачатка, либо в верхушку гифы в поздней фазе G1 приводит к случайному распределению актинового цитоскелета и последующему накоплению неуплотненных, увеличенных клеток [36, 45]. Модель S . cerevisiae CDC42 Мутант с делецией Δ оказался сверхчувствительным к обработке ауроном Sh2009 (ингибирование> 70%) в концентрации 16 мкМ (фиг. 7A).В Ш2009-лечил , С . albicans SC5314, CDC42 Экспрессия подавлялась вдвое (фиг. 10), что подтвердило бы нисходящий эффект Sh2009 на экспрессию CDC28 и HGC1 .

Cdc28 также контролирует клеточный цикл, регулируя репликацию ДНК. Ген MCM2 кодирует АТФ-связывающий белок, который является частью пререпликативного комплекса, известного как поддержание мини-хромосомы, состоящего из белков Mcm2-7, который действует как геликаза, раскручивая ДНК и инициируя репликацию ДНК [49] .В S . cerevisiae , после сборки комплекса MCM2-7 в фазе G1, MCM2-7 требует фосфорилирования на конце G1 с помощью комплекса Cdc28-kinase для рекрутирования ДНК-полимеразы и инициации репликации ДНК [50]. Обработка Sh2009 привела к значительному пятикратному снижению MCM2 через 1,5 часа после обработки (рис. 10), что может представлять дополнительный нисходящий эффект Sh2009 на Cdc28. Mmc2 также является АТФ-связывающим белком и, наряду с 12 другими белками, обогащенными химико-генетическим анализом взаимодействия, содержит широко распространенный мотив P-петли, поддерживающий нуклеотид-связывающие белки в качестве потенциальных мишеней для Sh2009 [51].

В дополнение к CDC28 , другие гены, которые кодируют нуклеотидсвязывающие белки, играющие роль в путях передачи сигнала, были идентифицированы у делеционных мутантов с дифференциальной чувствительностью к аурону Sh2009. Модель C . Гены albicans CDC25 и RAS1 подавлялись примерно в три и два раза, соответственно (рис. 10). CDC25 кодирует GTP-связывающий белок, который действует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов и является вышестоящим активатором сигнального пути Ras / cAMP, ответственного за активацию GTP-связывающего белка Ras1, который затем активирует синтез цАМФ, необходимый для клетки прогрессия цикла [52, 53].Кроме того, активация Ras1 синтеза цАМФ приводит к поддержанию роста гиф, фактора вирулентности при системном кандидозе, за счет регулирования G1 циклина Hgc1, который связывается с Cdc28, чтобы локализовать Cdc42 на кончике гифы [46]. Как свидетельствует предыдущее исследование, Sh2009 был единственным соединением аурона, которое нарушало формирование биопленки [21], что потребовало бы подавления роста гиф как ключевого компонента образования биопленок.

В отличие от сниженной экспрессии транскриптов RAS1 , транскрипты RAS2 были активированы в два раза после 3 ч обработки Sh2009 (фиг. 10). RAS2 кодирует GTPase в C . albicans , и предыдущее исследование показало, что уровни цАМФ у мутанта RAS1Δ снизились в 20 раз, но увеличились на ~ 10% у мутанта RAS2 Δ, что указывает на антагонистическую активность C . albicans Ras2 на уровни цАМФ через неизвестный механизм. В S . cerevisiae , как Ras1, так и Ras2 необходимы для активации синтеза цАМФ. Однако в отличие от S . cerevisiae , в которых Ras1 и Ras2 хорошо изучены и имеют гомологию последовательностей C . albicans RAS2 имеет плохую гомологию последовательности с S . cerevisiae RAS последовательностей [54]. Хотя ответ RAS2 на Sh2009 неясен из-за отсутствия исследований на C . albicans активности Ras2 или ее взаимодействия с другими участниками сигнального пути Ras / cAMP, повышающая регуляция транскриптов может быть ответом на понижающую регуляцию вышележащих молекул, на которую влияет Sh2009.

Другая активация транскрипции у обработанного Sh2009 C . albicans увеличивала экспрессию TSC11 через 1,5 часа обработки ауроном (фиг. 10). TSC11 кодирует GTP-связывающий белок, характеризуемый как регулирующий динамику цитоскелета актина во время поляризованного роста и эндоцитоза [55, 56]. Повышенная экспрессия TSC11 может быть механизмом детоксикации C . albicans для противодействия негативным эффектам Sh2009 на динамику актинового цитоскелета и эндоцитоз.Предыдущие исследования показали, что фенотипы мутантов TSC11 Δ (также известные как AVO3 или RICTOR у млекопитающих) имеют аномальную поляризацию актина [57], сниженную скорость эндоцитоза [58] и остановку прогрессирования клеточного цикла [59]. Другим геном, участвующим в эндоцитозе, проявляющим измененную экспрессию в ответ на Sh2009, был ERG3 , который подавлялся в три раза (фиг. 10). ERG3 участвует в пути биосинтеза эргостерола, и было документально подтверждено, что делеция гена снижает скорость эндоцитоза [60].Сниженная экспрессия ERG3 также может быть отнесена к вышестоящим эффектам Sh2009 на сигнальный путь RAS / cAMP, который положительно регулирует экспрессию семейства генов ERG [61].

Экспрессия гена RPS4a , который кодирует рибосомный белок 40S, снизилась вдвое при обработке Sh2009 (фиг. 10). Полногеномное исследование гаплонедостаточности C . alibcans Мутанты с делецией , которые были фракционированы на предмет аномального размера клеток, выявили гены, связанные с биогенезом рибосом и клеточным циклом, что указывает на корреляцию между скоростью биогенеза рибосом и прогрессированием клеточного цикла, зависящим от размера [62].В S . cerevisiae , подавляя синтез этого консервативного гена, RPS4a , приводит к остановке фазы G1 или значительно удлинению фазы G1, наряду с фенотипом увеличенного размера клеток [63], что может объяснить фенотип увеличенных клеток, наблюдаемый под микроскопом в Ш2009-обработанный С . albicans клеток (фиг.9).

Обсуждение

В этом исследовании мы исследовали in vitro противогрибковую активность биологически активного соединения, аурона Sh2009, в отношении широко используемых штаммов эталонного тестера устойчивости CLSI и дополнительных штаммов Candida spp.методом микроразбавления бульона CLSI [22]. Аурон Sh2009 был не только ингибитором для чувствительных штаммов, но также был ингибитором для устойчивых клинических изолятов. Клинические изоляты C . albicans M4: Gu2 и C . albicans M6: F1 были первоначально выделены как чувствительные к флуконазолу штаммы от двух ВИЧ-инфицированных пациентов, страдающих рецидивирующим ротоглоточным кандидозом. После двухлетнего периода лечения флуконазолом последние изоляты в каждой серии были устойчивыми к флуконазолу аналогами, известными как C . albicans M5: Gu5 и C . albicans M7: F5 [64]. С . albicans M5 и M7 приобрели мутации с усилением функции, что привело к гомозиготным аллелям транскрипционных факторов MRR1 и TAC1 , которые были задокументированы для сверхэкспрессии CDR1 / 2 (устойчивость к кандидозам) и MDR1 и Гены (множественной лекарственной устойчивости) для насосов оттока азола, соответственно [65]. Дополнительно C . albicans M2: ScTAC1R34A и C . albicans M3: ScMRR1R34A представляют собой устойчивые к флуконазолу штаммы, мутировавшие в C . albicans SC5314 фон для кодирования MRR1 P683S и TAC1 G980E гомозиготных активирующих аллелей соответственно. Как следствие этих мутаций индуцируется экспрессия оттокных насосов, вызывая снижение внутриклеточного накопления азолов и, в конечном итоге, высокую устойчивость к флуконазолу [66, 67].

События потери гетерозиготности как генетические изменения обычно связаны с устойчивостью к флуконазолу, что отражает способность C . albicans для генерации адаптивно-гомозиготных мутаций, что объясняется необычайной пластичностью C . albicans геном [68, 69]. Аурон Sh2009 показал значительно низкие значения IC 50 при ингибировании этих устойчивых к флуконазолу изолятов, что указывает на то, что высокоэкспрессированные оттокные насосы могут модулироваться ауроном Sh2009.Оттокные насосы CDR1 / 2 в основном являются белками-переносчиками АТФ-связывающей кассеты (АВС), которые используют энергию гидролиза АТФ для вытеснения лекарства из дрожжевой клетки [7]. Фактически, как это согласуется с предыдущими исследованиями раковых клеток, ауроны избирательно ингибировали перекачивающее действие этих переносчиков путем связывания с С-концевым нуклеотид-связывающим доменом Р-гликопротеина, который принадлежит к суперсемейству АТФ-связывающих кассет (ABC) [70 , 71]. Модулирующее действие ауронов на насосы оттока лекарств позволяет внутриклеточному накоплению соединения и связанной с ним токсичности, что меняет механизм устойчивости и делает резистентные клетки снова восприимчивыми, что делает эти биоактивные соединения привлекательными кандидатами в качестве реверсивных агентов для контроля устойчивости к лекарствам [ 72].

Изолят множественной лекарственной устойчивости С . albicans ATCC 64124 известен как штамм Дарлингтона, по имени пациента, страдающего хроническим кожно-слизистым кандидозом [73]. Штамм Дарлингтона, 64124, определяется как устойчивый ко всем противогрибковым средствам, кроме 5-фторцитозина в высокой концентрации [74]. Механизмы устойчивости к нескольким классам противогрибковых агентов штамма Дарлингтона не изучались, но недавно были опубликованы доказательства эволюции множественной лекарственной устойчивости, демонстрирующие эффективность клинического C . albicans изолятов адаптируются к длительному противогрибковому лечению [75]. Множественная лекарственная устойчивость считается многоступенчатым процессом, возникающим в результате постепенного накопления мутаций во время длительного противогрибкового лечения. Вкратце, устойчивость началась с лечения флуконазолом, которое вызывает активационную мутацию в TAC1 , с последующим воздействием каспофунгина, которое приводит к мутации в FKS1 . Затем лечение амфотерицином B вызывает мутацию потери функции в ERG2 .Следовательно, конечный штамм был штаммом с множественной лекарственной устойчивостью, который приобрел все три мутации и проявлял устойчивость к трем классам стандартных противогрибковых препаратов [7].

В отличие от C . albicans , который приобретает устойчивость, C . glabrata устойчив к азольным препаратам из-за ~ 67 мутаций усиления функции в гене транскрипционного фактора CgPDR1 , что приводит к сверхэкспрессии CgCDR1 / 2 -кодированных оттокных насосов [76].Это могло объяснить резкое увеличение C . glabrata инфекций с момента появления азольных препаратов в 1980-х годах, идентифицируя C . glabrata как вторая по частоте причина кандидоза, отличная от albicans . Лекарственная устойчивость C . glabrata обнаружен не только для азолов, но и для всех известных противогрибковых препаратов, что представляет собой серьезную проблему для противогрибковой терапии для организма [77]. Наши результаты показали, что аурон Sh2009 эффективно ингибирует Candida spp.роста и демонстрировал приемлемые фармакодинамические свойства (киллинг, зависящий от времени и концентрации), аналогичные флуконазолу, в качестве ценной оценки для перспективного противомикробного агента [78].

После установления противогрибковой активности Sh2009 мы приступили к характеристике противогрибкового механизма. Изучение механизма действия нового лекарственного средства является важной предпосылкой для улучшения терапевтического действия и предотвращения нежелательных побочных эффектов, но это было проблемой при открытии лекарств из-за больших затрат времени и средств.Однако с тех пор, как в 2002 г. была создана первая коллекция делеций дрожжей [79], хемогеномное профилирование было доказано как мощная система для характеристики способа действия и молекулярных мишеней некоторых лекарств [80], а также тысяч дополнительных биоактивных молекул [ 81, 82]. Недавно было рассмотрено значительное количество исследований широкого спектра биологических активностей ауроновых соединений как противоопухолевых агентов, идентифицированных с использованием подходов на основе фенотипа, с использованием существующих знаний о данном клеточном процессе, ингибируемом ауронами, включая ингибирование CDK, разрезание ДНК, гистоны. деацетилаза, топоизомераза, переносчик АТФ-связывающих кассет и полимеризация тубулина [83].Напротив, здесь был применен генетический подход, чтобы всесторонне выявить все биологические эффекты лечения ауроном как потенциальным противомикробным средством. Хемогеномный подход, который использовался в этом исследовании, представляет собой метод обратной генетики, который позволяет всестороннюю идентификацию продуктов генов, которые функционально взаимодействуют с биоактивными молекулами, путем экспонирования ранее сконструированных библиотек S . cerevisiae мутантов в интересующем состоянии, которые в этом исследовании подвергались воздействию нового аурона Sh2009.Эти мутанты дрожжей несут делеции большей части (96%) генома дрожжей, с только одним мутантом на ген с делецией. Из-за почти полного охвата генома дрожжей этот подход гарантирует объективные результаты, поскольку он полностью отображает все мишени (биологические ответы) одновременно под термином взаимосвязанных путей эукариотической клетки [84].

В данном исследовании хемогеномное профилирование S . cerevisiae мутанты с ауроном Sh2009 определили роли генов, участвующих в клеточном цикле, репликации ДНК, делении клеток, актиновом цитоскелете и эндоцитозе.Обогащающий анализ биологических ответов у гетерозиготных и гомозиготных мутантов сначала проводили отдельно для подтверждения значимых ответов в каждом пуле. Затем ответы были объединены для картирования функциональной сети аннотаций путей KEGG, биологических ответов и молекулярных функций одновременно с использованием анализа обогащения GO, чтобы обнаружить, что наиболее чувствительные гетерозиготные и гомозиготные мутанты сгруппированы по актиновому цитоскелету и процессам эндоцитоза. Анализ обогащения ГО также использовался для картирования пути клеточного цикла как наиболее значительно обогащенного пути, также охватывающего другие обогащенные биологические процессы и выявления нуклеотид-связывающих белков как молекулярной функции большинства значительно обогащенных генов.

Нуклеотидсвязывающие белки играют центральную роль во множестве основных клеточных процессов, включая передачу сигналов клеток, пролиферацию, сборку цитоскелета, синтез белка и апоптоз [85]. Низкое количество GTP-связывающих белков, которые были идентифицированы в этом исследовании, можно объяснить относительно низким содержанием GTP-связывающих белков в природе по сравнению с ATP-связывающими белками [86]. Тем не менее, поскольку трифосфаты пуриновых нуклеозидов имеют сходную структуру, некоторые АТФ-связывающие белки могут использовать GTP в качестве донора фосфата и наоборот [87].В этом отношении аурон Sh2009 может обладать сродством к одному и тому же сайту связывания в разных, но родственных нуклеотидсвязывающих белках, следовательно, влияя на более широкий спектр клеточных процессов. Функциональное обогащение генов, кодирующих нуклеотидсвязывающие белки во время анализа пула делеций основных и второстепенных генов, предполагает, что аурон Sh2009 потенциально взаимодействует с нуклеотидсвязывающими белками, что приводит к ряду клеточных дефектов, влияющих на клеточный цикл, актиновый цитоскелет, и эндоцитоз.Бензофураноновое кольцо Sh2009 может определять биологическую активность из-за имитации аденина, впоследствии подавляя активность АТФ-зависимых белков [88].

Наш химико-генетический анализ взаимодействия и обогащения также предполагает, что лечение ауроном Sh2009 нацелено на нуклеотид-связывающие белки, вызывая изменения в клеточном цикле, организацию актинового цитоскелета и эндоцитоз в S . cerevisiae . Эти фенотипические изменения в ответ на Sh2009 были подтверждены в C . albicans SC5314 с использованием анализа сортировки клеток с помощью проточной цитометрии, который выявил увеличенные популяции клеток в фазе G1 после 3 часов обработки ауроном Sh2009. В S . cerevisiae , гетерозиготные мутанты с делециями генов для белков, влияющих на цикл клеточного деления ( CDC5 Δ, CDC34 Δ, CDC42 Δ, CDC25 Δ и CDC13 Δ), которые чувствительно реагируют на ауронию Sh. все они контролируются главным регулятором клеточного цикла (CDK) Cdc28, каталитической киназой, которая соединяется с активирующими субъединицами, такими как Clb3 и Cln2 [89], гены которых оба ответили на Sh2009 как гомозиготно-устойчивые мутанты.Также накопление Ш2009-обработал C . albicans клеток в фазе G1 означает, что клетки находятся в остановке клеточного цикла и еще не участвуют в синтезе ДНК, что также подтверждает результаты химико-генетического взаимодействия, в результате которого мутанты репликации ДНК POL3 Δ, MCM2 Δ, MCM7Δ , RFC1Δ , RFC3Δ и ORC4 Δ из профиля HIP были чувствительны к Sh2009. В C . albicans , экспрессия генов на разных стадиях клеточного цикла ранее была охарактеризована с использованием технологии микрочипов [90].В этом исследовании сообщается об экспрессии нескольких генов, необходимых для перехода G1 / S, и некоторые из этих генов идентифицированы как чувствительные или устойчивые мутанты из наших химико-генетических профилей, включая POL3 для субъединицы ДНК-полимеразы, RFC1 и RFC2 для элементов фактора репликации ДНК, TOF1, ген для контрольной точки репликации ДНК, CSM3, ген для точной сегрегации хромосом, SWI4 фактор транскрипции для активации перехода G1 (рис. 6).

Наши результаты также согласуются с предыдущим исследованием, в котором сообщается, что ауроны останавливают клеточный цикл посредством нацеливания (CDK) на белок Cdc28, что делает ауроны многообещающим кандидатом для лечения рака [12]. Среди различных производных аурона, синтезированных в качестве потенциальных противоопухолевых агентов, было обнаружено, что соединения аурона, которые имеют метоксигруппу в положении 4 кольца B, такие как аурон Sh2009, обладают повышенной антипролиферативной активностью за счет значительной остановки клеточного цикла в фазе G2 / M [83] .В нашем исследовании флуоресцентная визуализация была выполнена для обнаружения деполяризации актинового цитоскелета как следствие нарушения аурона Sh2009 перестройки актиновых пятен в зачатке в конце фазы G1, что приводит к остановке клеточного цикла в фазе G1. Эти фенотипические данные подтверждают хемогеномные ответы S . cerevisiae гены CDC28 Δ, CLN2 Δ и CDC42 Δ к Sh2009, поскольку было хорошо охарактеризовано, что циклин G1 Cln2 связывается с Cdc28, чтобы локализовать Cdc42, способствуя поляризации актина и фазовому переходу G1 / S [ 36].

Хемогеномное профилирование имеет ограничения; например, клеточные механизмы, на которые влияет Sh2009, были идентифицированы с использованием роста в качестве единственной конечной точки, что могло привести к отбору по ложноположительной чувствительности из-за медленного роста некоторых делеционных мутантов или, в худшем случае, к потере необходимых мутантов. Еще одним ограничением является то, что ответы в S . cerevisiae отличаются от ответов C . albicans из-за способности C . albicans для производства настоящих гиф и различий в чувствительности и устойчивости к противогрибковым препаратам. Для подтверждения конкретных ответов гена в C . albicans , относительные уровни мРНК генов, идентифицированных как дифференциально чувствительные, были количественно определены в C . albicans SC5314. Значительная часть генов, которые функционируют в развитии клеточного цикла, по-разному регулируется в ответ на Sh2009, что приводит к потенциально иерархическому пути, начинающемуся с Cdc25 и Ras1, которые регулируют G1 циклин Hgc1, который связывается с Cdc28 для локализации Cdc42, что приводит к поляризации актина. и прогрессирование клеточного цикла.Cdc25 и Ras1 регулируют сигнальный путь RAS / cAMP, который контролирует поддержание Erg3 нормальной скорости эндоцитоза. Транскрипционные изменения в генах этих молекул поддерживают биологические ответы, наблюдаемые в фенотипических исследованиях.

Два гена, CBK1 и RSP5 , идентифицированные с помощью хемогеномного профилирования в S . cerevisiae , не продемонстрировали значительной дифференциальной экспрессии по сравнению с обработкой Sh2009 в C . albicans несмотря на их соответствующие документированные роли в поляризованном росте [91] и организованных актиновых пятнах с нормальным эндоцитозом [42]. CBK1 Δ-мутант был среди 20 лучших чувствительных гетерозиготных мутантов с делецией (таблица S2), а Δ-мутант RSP5 был подтвержден с использованием кривых роста его чувствительности к Sh2009 (рис. 7A). Неспособность обнаружить изменения в экспрессии генов может быть связана со сроками экспрессии или несоответствием между регуляцией и экспрессией генов. В S . cerevisiae , мутант TSC11Δ был гиперчувствителен к Sh2009, однако этот ген был усилен транскрипцией у C albicans , что могло указывать на разницу в ответах на выживание между двумя дрожжами.Это подчеркивает, что, хотя это исследование подтвердило химико-генетическое взаимодействие с использованием S . cerevisiae Коллекция мутантов для характеристики механизма действия нового биоактивного ауронового соединения против C . albicans , исследования химико-генетического взаимодействия также могут быть использованы для выяснения потенциальных различий в ответах на лекарства между организмами.

Материалы и методы

Материалы и реактивы

Candida штаммов (перечисленных в таблице S1) были предоставлены Dr.Лаборатория П. Дэвида Роджерса Центра медицинских наук Университета Теннесси, Мемфис, Теннесси. Линии клеток человека; THP-1 (ATCC, TIB-202), HepG2 (ATCC, HB-8065) ​​и A549 (ATCC, CCL-185) были приобретены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Модифицированная Дульбекко культуральная среда Игла (DMEM), 1X раствор трипсина-ЭДТА, фетальная бычья сыворотка (FBS), 100X раствор пенициллина / стрептомицина, амфотерицин B, каспофунгин, флуконазол, итраконазол, 5-фторцитозин, агар YPD и бульон, цитохалазин D, буфер 3- (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS) и метилметансульфонат (MMS) были приобретены у Sigma-Aldrich (St.Луис, Миссури, США). Среда RPMI-1640 была приобретена у Corning Incorporated (Коринг, Нью-Йорк, США). Селективный антибиотик генетицин (сульфат G-148), фосфатно-солевой буфер (PBS), родамин фаллоидин, йодид пропидия, PrestoBlue и фермент RNaseA были приобретены у Life Technologies Corporation (Карлсбад, Калифорния, США). 4% параформальдегид был приобретен у Alfa Aesar (Уорд Хилл, Массачусетс, США), а зимолаза 20Т была приобретена у MP Biomedicals, LLC (Солон, Огайо, США). Коллекции делеций дрожжей (~ 1056 гетерозиготных мутантов и ~ 4320 гомозиготных мутантов) были приобретены у GE Healthcare Life Sciences (Питтсбург, Пенсильвания, США) и ThermoFisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США), соответственно.

Тест на чувствительность к противогрибковым препаратам

Приготовление маточных растворов.

Aurone Sh2009 был синтезирован, как описано во вспомогательной информации (файл S1). Порошок Sh2009 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до высокой концентрации 20 мМ. Были приготовлены двукратные серийные разведения при концентрациях от 200 до 3,125 мкМ с использованием среды RPMI – 1640, предварительно забуференной до pH 7,0 с помощью MOPS и стерилизованной фильтрацией. Используя 96-луночные микротитрационные планшеты, 100 мкл каждой концентрации Sh2009 добавляли в соответствующие лунки с четырьмя повторами для каждой концентрации.Амфотерицин B и каспофунгин использовали в качестве положительного контроля, чтобы гарантировать 100% ингибирование роста дрожжей при концентрациях 16 мкг / мл и 8 мкг / мл соответственно. Кроме того, флуконазол, итраконазол и 5-фторцитозин получали в соответствии с инструкциями производителя, серийно разводили в два раза в соответствии с концентрациями протокола CLSI [22] и использовали в качестве эталона для некоторых штаммов для подтверждения их профилей устойчивости.

Приготовление посевного материала.

Штаммы для этого исследования (таблица S1) культивировали на агаре YPD и инкубировали при 35 ° C в течение 24 часов.Суспензии инокулята для каждого штамма готовили в соответствии с протоколом микроразбавления бульона CLSI для тестирования дрожжей на противогрибковую чувствительность [22]. Суспензию 5–6 колоний встряхивали примерно в 4 мл стерильного физиологического раствора (0,85% NaCl) и спектрофотометрически доводили до оптической плотности при длине волны 530 нм (OD 530 ), которая варьировалась от 0,12 до 0,15. Затем инокулят разбавляли 1: 1000 в среде RPMI 1640, получая рабочую концентрацию от 1 × 10 3 до 5 × 10 3 КОЕ / мл.Объемы 100 мкл каждого посевного материала для каждого штамма добавляли в лунки соответствующего планшета. Для каждого изолята были лунки без лекарств и лунки для контроля среды с 1% ДМСО и без него для обнаружения любых загрязнений в среде и для использования в качестве оптического бланка для измерений оптической плотности и флуоресценции.

Анализ ингибирования.

После 24 ч инкубации при 35 ° C в каждую лунку для микротитрования добавляли 20 мкл реагента PrestoBlue до конечной концентрации 10%, после чего планшеты инкубировали при 35 ° C в течение дополнительных 60–70 мин [21].Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) были определены как концентрация аурона 1009, которая снижает рост на 90%. Величину МИК определяли количественно путем измерения флуоресценции, которая возникает в результате восстановления голубого нефлуоресцентного резазурина до красно-флуоресцентного резоруфина в результате метаболической активности активных клеток при возбуждении 560 нм и эмиссии 590 нм с помощью спектрофотометра SpectraMax M5e (Molecular Devices , LLC, США). Процент роста дрожжей рассчитывали путем сравнения показаний флуоресценции лунок, содержащих лекарственное средство, с показаниями лунок, свободных от лекарственного средства, для расчета МИК 90 .Анализ для каждого штамма проводили в двух экземплярах. Значения IC 50 рассчитывали с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software, США).

Анализ жизнеспособности клеток.

Используя 24-луночные планшеты, C . albicans Клетки SC5314 культивировали и обрабатывали 200 мкМ Sh2009 в 2 мл среды RPMI 1640, как описано выше. После инкубации при 35 ° C в течение 48 ч 1 мл клеток, обработанных Sh2009, необработанных клеток и ранее приготовленных клеток, убитых изопропанолом, промывали PBS.Затем образцы разбавляли приблизительно до 1 × 10 6 клеток / мл в PBS и окрашивали в соответствии с протоколом набора жизнеспособности живых / мертвых дрожжей Fungalight (ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Окрашенные клетки исследовали на их жизнеспособность с помощью проточной цитометрии (Guava Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США) с программным обеспечением Guava InCyte. Чтобы различать живые и мертвые клетки на точечной диаграмме, селекцию дрожжевой популяции определяли на основе уровней красной и зеленой флуоресценции убитых изопропанолом клеток.

Анализ скорости роста.

В 100-луночных сотовых планшетах Bioscreen, C . albicans Клетки M1: SC5314 культивировали и обрабатывали ауроном Sh2009 (3,125-200 мкМ) в среде RPMI 1640, как описано выше. Планшеты загружали в прибор Bioscreen C с программным обеспечением Bioscreen (Growth Curves USA, Piscataway, NJ, USA) при температуре 35 ° C при непрерывном встряхивании и измерениях с 30-минутным интервалом при OD 530 в течение 40 часов. Кривые роста использовали для сравнения роста необработанного C . albicans клеток с обработанными Sh2009 клетками при различных концентрациях аурона. Подтверждение клеточной чувствительности и резистентности S . cerevisiae мутантов Sh2009 также были получены с помощью прибора Bioscreen C таким же образом для C . albicans , за исключением среды, представляющей собой бульон YPD, и инкубация проводилась при 30 ° C.

Time-kill assay.

Для оценки фунгицидной активности аурона Sh2009 был использован ранее описанный и оцененный противогрибковый метод тайм-килла [92].Исходный посевной материал C . albicans SC5314 в диапазоне 0,5–1,0 × 10 5 КОЕ / мл обрабатывали концентрацией аурона примерно в пять раз выше (500 мкМ), чем разведение, дающее IC 50 Sh2009 (16,25 мкМ) в двух серии разведения. Флуконазол (16 мкг / мл) использовали в качестве фунгистатического контроля, а амфотерицин B (8 мкг / мл) использовали в качестве фунгицидного контроля. После инкубации при 35 ° C 10 мкл каждой обработки наносили на агар YPD через 0, 6, 12, 24 и 30 часов обработки, и планшеты инкубировали при 35 ° C в течение 24 часов для определения количества жизнеспособных клеток.Фунгицидная активность была определена как ≥ 3 –log 10 , что эквивалентно снижению на 99,9% КОЕ / мл от рабочей концентрации 0,25–0,5 × 10 5 КОЕ / мл.

Анализ цитотоксичности

Линия эпителиальных клеток карциномы легких человека A549 и линия моноцитарных клеток THP-1 человека выращивали в культуральной среде RPMI-1640, тогда как эпителиальные клетки карциномы печени человека HepG2 выращивали в культуральной среде DMEM. В обе среды добавляли 10% FBS и 1% антибиотики пенициллин-стрептомицин.После поддержания роста клеток при 37 ° C с 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе до достижения 90% слияния клетки A549 и HepG2 трипсинизировали с помощью 1X трипсин-EDTA и ресуспендировали в свежей среде. Клетки высевали в 96-луночные микротитрационные планшеты при плотности 10000 жизнеспособных клеток / лунку и выращивали в течение ночи, в то время как суспензионные клетки THP-1 высевали непосредственно в 96-луночные микротитрационные планшеты при той же плотности перед обработкой. Конечные концентрации аурона Sh2009 были приготовлены в двукратных серийных разведениях (3.125–200 мкМ), как описано выше для анализа чувствительности к противогрибковым препаратам. Затем среду, содержащую клетки A549 или HepG2, заменяли после инкубации в течение ночи 200 мкл свежей культуральной среды, содержащей конечные концентрации Sh2009. Затем клетки инкубировали в течение дополнительных 24 часов при 37 ° C с 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе. Для оценки жизнеспособности клеток каждую лунку обрабатывали 20 мкл PrestoBlue в течение 3–6 часов. Метаболически активные клетки превращали синий нефлуоресцентный краситель резазурин в розовый флуоресцентный краситель резоруфин, который можно измерить с помощью планшет-ридера, как описано выше, в анализе противогрибкового ингибирования.Triton X-100 (1%, против / против ) использовали в качестве положительного контроля, чтобы дать полную потерю жизнеспособности клеток. Процент жизнеспособности клеток рассчитывали следующим образом: [(значение отрицательного контроля - обработанное значение) × 100] / значение отрицательного контроля. Анализ каждой клеточной линии проводили в трех повторностях. Значения CC 50 рассчитывали с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software, США).

Хемогеномное профилирование в

Saccharomyces cerevisiae
Объединение отдельных мутантов в единый пул.

Коллекции с делециями дрожжей получали в виде индивидуальных мутантов в 96-луночных планшетах, которые хранили при -80 ° C. И пул делеций HIP, и пул делеций HOP были созданы отдельно, как описано ранее [84, 93]. 96-луночные планшеты с исходными мутантами полностью оттаивали, после чего 96-луночный штифт для переноса использовали для переноса небольшого объема мутантов в Nunc Omni Tray, содержащий агар YPD с генетицинным антибиотиком. Между переносами 96-луночный штифт для переноса стерилизовали этанолом и трижды обжигали.После выращивания клеток в течение 48 ч при 30 ° C регистрировали отсутствующие и медленно растущие мутанты, и отдельно добавляли удвоенную массу этих мутантов. Работая в стерильном вытяжном шкафу, каждый лоток заполняли ~ 10 мл бульона YPD, и все образованные колонии осторожно соскребали с помощью стерильного разбрасывателя клеток. Ресуспендированные колонии переносили в стерильную колбу на 1000 мл со стерильной мешалкой. Суспензию перемешивали в течение 5 мин на мешалке для получения гомогенизированного пула. Концентрацию свежеприготовленного пула доводили до 125–250 клеток / мутант / мкл центрифугированием при 500 × g .Как только концентрация была отрегулирована, стерильный глицерин был добавлен до 15% (об. / Об.) И 200 мкл аликвоты пула хранили в пробирках для ПЦР-стрипов при -80 ° C.

Объединенное соревнование с ауроном Sh2009.

Перед тем, как подвергнуть объединенные делеционные мутанты Sh2009, необходимо определить ингибирующую концентрацию примерно 20% от S . cerevisiae S288C родительский штамм дикого типа этих мутантов определяли (500 мкМ), как описано ранее [93]. Используя 96-луночные планшеты, 8 лунок заполняли 198 мкл Sh2009, разведенного в бульоне YPD в концентрации 500 мкМ с содержанием не более 1% ДМСО.Для положительного контроля 8 лунок заполняли 198 мкл MMS, разведенного в бульоне YPD в концентрации 0,01 мкг / мл. Для отрицательного контроля 8 лунок были заполнены 198 мкл бульона YPD только с 1% ДМСО. Две аликвоты, которые были приготовлены из предыдущего шага пула делеций HOP (~ 4320 мутантов), представляющих несущественные гены, и пула делеций HIP (~ 1056 мутантов), представляющих основные гены, были полностью разморожены. Объем 2 мкл при соотношении 125–250 клеток / мутант / мкл пула несущественных делеций добавляли в каждые 12 лунок, содержащих Sh2009, MMS и 1% ДМСО.Таким же образом 2 мкл пула существенных делеций при концентрации 125–250 клеток / мутант / мкл добавляли в каждые оставшиеся 12 лунок Sh2009, MMS и 1% ДМСО. После 48-часовой инкубации при 30 ° C клетки из каждой лунки собирали независимо путем пипетки вверх и вниз и центрифугирования при ~ 20 000 x g в течение 3 минут. Супернатант удаляли и осадок обрабатывали для экстракции геномной ДНК.

Построение библиотеки ДНК.

Гранулы из 24 образцов ресуспендировали индивидуально в 125 мкл раствора зимолиазы и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C.ДНК экстрагировали из всех 24 образцов в соответствии с руководством по набору ДНК растений Maxwell 16 LEV (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Для амплификации уникальных штрих-кодов ДНК UPTAG длиной 20 п.н., как описано ранее [93], 24 реакции ПЦР были подготовлены независимо, так что была одна реакция ПЦР для каждого образца в общем объеме 25 мкл следующим образом: 21,5 мкл смеси Taq, 0,5 мкл обратного общего праймера при 0,5 мкМ, 0,5 мкл индексированного праймера при 0,5 мкМ (для каждого образца использовался отдельный индексированный праймер, таблица S5) и 2.5 мкл геномной ДНК при ~ 100 нг. Условия ПЦР были следующими: 5 мин при 95 ° C для начальной денатурации, затем 30 циклов по 1 мин при 95 ° C, 30 с при 55 ° C, 45 с при 68 ° C, затем 10 мин при 68 ° C для окончательного расширения. После реакций ПЦР 25 мкл всех продуктов ПЦР были объединены вместе из отдельных пробирок для ПЦР в одну библиотеку пробирок. Эту библиотеку очищали разделением на 2% агарозном геле TAE в течение 50 мин при 120 В. Желаемую полосу (267 п.н.), содержащую штрих-коды амплифицированной ДНК UPTAG, вырезали и очищали от геля с использованием набора QIAGEN Quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Germantown, MD, USA).Библиотеку разводили до 1: 5 000, 1: 10 000 и 1: 20 000 и количественно оценивали с помощью набора для количественной оценки библиотеки KAPA (KAPA Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США) и системы ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX96 (Hercules, Калифорния, США). СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). После количественной оценки правильной концентрации библиотеки библиотеку готовили в качестве матрицы ДНК в конечной концентрации 15 нМ с 5% -ным добавлением контроля PhiX в соответствии с Руководством по денатурированию и разбавлению библиотеки MiSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния). , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). Секвенатор Illumina MiSeq был использован для запуска ДНК-матрицы в течение 1 × 50 циклов, чтобы получить плотность кластеров 700-900 к / мм 2 .

Анализ данных после секвенирования.

Секвенсор Illumina сгенерировал файл Fastq, который был преобразован в файл Fasta с помощью конвертера из-за простоты управления файлом Fasta [78]. Для обработки и анализа чтения последовательности были созданы сценарии Perl (https://github.com/fma3b/Barcode_Seq_Analysis) [94]. Два файла необработанных подсчетов для профилей HIP-HOP были импортированы в таблицу Excel (Microsoft Corporation, США) для нормализации абсолютных показателей и расчета показателей пригодности, Z-показателей, значений P и значений FDR после расчетов, о которых сообщалось ранее [84 ].Считанные необработанные последовательности были депонированы в архиве считывания последовательностей (SRA) под номером проекта PRJNA4. Обогащающий анализ пути KEGG и анализ онтологии генов (GO) был проведен с использованием гипергеометрического тестирования с помощью программного обеспечения ClueGo, чтобы найти значительно обогащенные термины KEGG / GO с использованием категорий GO в Saccharomyces cerevisiae -S288C в качестве фона. Для визуализации интерактивной сети аннотаций между значимыми генами использовались приложения ClueGO и CluePedia [29, 31], а также Cytoscape (Cytoscape Consortium, США).

Проточная цитометрия

С . albicans Клетки SC5314 выращивали при 30 ° C до достижения экспоненциальной фазы, разбавляли до ~ 1,2–3 × 10 6 КОЕ / мл и обрабатывали Sh2009 при концентрации IC 50 с последующей инкубацией в течение дополнительных 3 часов. . После сбора центрифугированием супернатанты удаляли, а осадки промывали PBS, а затем фиксировали холодным 70% этанолом при -20 ° C в течение 2 часов. Фиксированные клетки промывали PBS и ресуспендировали в 500 мкл PBS, содержащего 20 мкг / мл РНКазы, и инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов.К обработанным клеткам добавляли 200 мкл PBS, содержащего 20 мкг / мл иодида пропидия (PI). Используя проточный цитометр Millipore Guava, было подсчитано 5000 событий и измерена интенсивность флуоресценции PI. После сбора данных с помощью программного обеспечения Guava PCA-96 данные были стробированы, чтобы исключить мусор или агрегаты. Эксперименты проводили в трех повторностях с использованием цитохалазина D, который, как сообщается, останавливает клеточный цикл [35], в качестве положительного контроля.

Конфокальная микроскопия

С . albicans Клетки SC5314 выращивали при 35 ° C до достижения экспоненциальной фазы, затем разбавляли до ~ 1,2–3 × 10 6 КОЕ / мл. Добавляли аурон Sh2009 при концентрации IC 50 и клетки инкубировали в течение 3 часов. Клетки фиксировали добавлением 4% параформальдегида и затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После осаждения и промывания клеток PBS клетки инкубировали с 1% Triton-X100 в течение 1 ч при комнатной температуре. К клеткам добавляли родамин фаллоидин (RP) с последующей инкубацией в темноте при 4 ° C в течение 1 часа.После двух промывок PBS клетки были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии (Zeiss, Thornwood, NJ, USA) при 60-кратном увеличении. Распределение актина в клетках оценивали с учетом того, что актин деполяризован, если в материнской клетке наблюдали более пяти пятен [95]. Приблизительно 100 клеток подсчитывали за эксперимент в трех повторностях экспериментов. Модель S . cerevisiae CDC42 Δ-мутант использовали в качестве положительного контроля.

RT-qPCR

После выращивания C . albicans SC5314 клеток при 30 ° C в бульоне YPD до достижения экспоненциальной фазы, культуру обрабатывали ауроном Sh2009 при концентрации IC 50 с последующей инкубацией в течение дополнительных 1,5, 3 и 6 часов. После сбора клеток центрифугированием РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями набора Maxwell 16 LEV Plant RNA Kit. Общую РНК из обработанных и необработанных образцов нормализовали до 1 мкг. кДНК была сконструирована в соответствии с протоколом производителя набора SuperScript IV First-Strand Synthesis System (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) с использованием 10 нг РНК.RT-qPCR была предварительно сформирована с использованием 2 × iQ SYBR green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) в условиях рекомендованного цикла. Все реакции проводили в трех экземплярах с использованием перечисленных пар праймеров (таблица S6). Уровни транскриптов нормализовали до уровня экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH и сравнивали с необработанным образцом с использованием метода ΔΔC T [96].

Иммунология онкологических систем | eLife

Обещание проекта «Геном человека» и секвенирования всего генома (WGS) вдохновило на разработку технологий –omics, способных охарактеризовать полноту конкретного атрибута в образце.Такие подходы включают, помимо прочего, геномику, транскриптомику, эпигеномику, протеомику, метаболомику, липидомику (Yang and Han, 2016) и гликомику (Bennun et al., 2016; Cummings and Pierce, 2014; Bertozzi and Sasisekharan, 2009). ), и их текущие проявления обычно используют варианты секвенирования следующего поколения (NGS) или масс-спектрометрии (MS). Массовые реализации этих технологий (то есть тех, которые требуют нескольких ячеек в качестве входных данных - часто от тысяч до миллионов) были предшественниками многих одноклеточных версий, которые в последнее время стали популярными.Хотя эти технологии сами по себе не обеспечивают разрешение отдельных ячеек, они часто обеспечивают степень чувствительности, которая еще не может быть достигнута на уровне отдельных ячеек (например, большинство гликомик). Кроме того, стоимость этих подходов обычно значительно ниже, чем их одноклеточные аналоги. Сложные смеси клеток могут быть очищены с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), магнитной очистки или микрожидкостных систем до того, как подвергнуть их этим технологиям, а недавние вычислительные подходы обеспечивают средства деконволюции смешанных популяций, когда очистка невозможна или данные об экспрессии генов из таких смешанных популяций уже были собраны (Racle et al., 2017; Ньюман и др., 2015; Newman et al., 2019; Ан и др., 2013; Йошихара и др., 2013; Гонг и Шустаковски, 2013; Ли и др., 2016b; Becht et al., 2016; Шен-Орр и др., 2010; Чжун и др., 2013; Аран и др., 2017; Quon et al., 2013; Шен-Орр и Гужу, 2013; Валлания и др., 2018; Du et al., 2019).

Краеугольными технологиями, лежащими в основе как системной биологии рака, так и системной иммунологии, являются геномное секвенирование (WGS и секвенирование всего экзома, WES) и транскриптомное секвенирование (секвенирование РНК (RNA-seq)) (Таблица 1).По своей сути рак - это генетическое заболевание; злокачественная трансформация является следствием мутаций в генах-супрессорах опухолей и онкогенах (Stratton et al., 2009). WGS и WES пролили свет на вклад множественных мутаций или вариаций числа копий в таких генах, а RNA-seq выявила пути и сигнальные сети, участвующие в прогрессировании опухоли (Creixell et al., 2015; Lawrence et al., 2014; Garraway and Lander, 2013). Хотя геномы лейкоцитов демонстрируют значительно меньшую вариабельность, чем геномы злокачественных популяций, существуют заметные исключения, такие как рецептор B-клеток (BCR) и рецептор T-клеток (TCR), присутствующие на B и T-лимфоцитах соответственно.Геномные локусы для этих рецепторов претерпевают перестройку для создания разнообразия доменов распознавания антигена таким образом, который обеспечивает специфический иммунитет против огромного ряда патогенов (Hozumi and Tonegawa, 1976). Повышенная экспрессия различных нормальных белков, экспрессия эмбриональных белков и антигенов и экспрессия мутировавших белков (неоантигенов) - все это мишени на опухолевых клетках, которые могут распознаваться BCR и TCR, вызывая противоопухолевые ответы иммунной системы.Следовательно, иммунологи онкологических систем использовали целевое секвенирование ампликонов (обычно кДНК, полученной из амплифицированной мРНК TCR или BCR) для оценки репертуаров BCR и TCR, что позволяет понять, как лимфоциты реагируют на опухоли (Han et al., 2016; Page et al. ., 2016; Woodsworth et al., 2013; Sims et al., 2016; Linnemann et al., 2013; Jiang et al., 2019; Liu et al., 2018; Chaudhary, Wesemann, 2018; Zhang et al., 2017b). Кроме того, исследователи использовали WES, часто в сочетании с RNA-seq, для определения диапазона потенциальных неоантигенов, экспрессируемых опухолевыми клетками в результате их высокой частоты мутаций (Garcia-Garijo et al., 2019). Наконец, RNA-seq позволил исследователям идентифицировать генные сети и программы транскрипции, используемые опухолями для обхода противоопухолевого иммунитета, а также изменения состояния иммунных клеток при их взаимодействии с опухолями.

В то время как геномный и транскриптомный анализ были опорой для системных биологов, как биология рака, так и иммунология извлекли пользу из эпигенетических исследований (Egger et al., 2004; Flavahan et al., 2017; Esteller, 2008; Suvà et al., 2013; Li et al., 2013; Schmidl et al., 2018; Бусслингер, Тараховский, 2014; Peng et al., 2015; Бердаско и Эстеллер, 2010; Файнберг и Фогельштейн, 1983; Хеннинг и др., 2018). Ряд технологий позволил исследовать эпигенетический контроль регуляции генов, и, объединив эти методы с подходами NGS, способными запрашивать весь геном, исследователи смогли применить анализ на системном уровне к эпигенетике (таблица 2). Метилирование представляет собой одну из наиболее распространенных эпигенетических модификаций для подавления транскрипции (Jones and Takai, 2001) и может быть исследовано на уровне генома с помощью полногеномного бисульфитного секвенирования (WGBS) или бисульфитного секвенирования с пониженной репрезентативностью (RRBS), которые используют бисульфит натрия для преобразования неметилированных остатков цитозина в урацил, оставляя их метилированные аналоги (5-метилцитозин) нетронутыми (Frommer et al., 1992; Lister et al., 2009; Meissner et al., 2005; Бут и др., 2012; Бут и др., 2014; Ю. и др., 2012). Чтобы узнать, как определенные белки (например, факторы транскрипции) взаимодействуют с ДНК, исследователи часто используют иммунопреципитацию хроматина (ChIP). В этом подходе ДНК поперечно сшивается с белками, с которыми она взаимодействует, расщепляется и осаждается за счет использования антител против интересующего белка (Gilmour and Lis, 1985). Комбинирование ChIP с NGS (ChIP-seq) позволяет создавать общегеномные карты связывания ДНК с интересующими белками (Johnson et al., 2007; Барский и др., 2007). Усовершенствованная версия, известная как CUT и RUN, также позволяет выполнять аналогичный подход на месте со значительно меньшим фоном (Skene and Henikoff, 2017). В иммунологии Bisulfite-Seq и ChIP-seq оказались эффективными инструментами для выявления лежащих в основе эпигенетических модификаций, влияющих на решения судьбы и состояния активации лейкоцитов (Henning et al., 2018; Northrup and Zhao, 2011; Zhang et al., 2012; Russ и др., 2014; Абдельсамед и др., 2017). Модификации гистонов представляют собой одни из наиболее важных регуляторов состояний клеток (Strahl and Allis, 2000), и ChIP-seq оказался одной из наиболее эффективных технологий для исследования таких изменений.Например, ChIP-seq был использован для определения ландшафта суперэнхансеров (SE) в Т-клетках CD4 + и определения того, как полиморфизмы в этих регионах могут усиливать риск аутоиммунного заболевания (Vahedi et al., 2015). Точно так же, используя ChIP-seq для профилирования различных паттернов метилирования и ацетилирования гистона h4, исследователи обнаружили регуляторные эпигенетические сигнатуры, которые различают наивную, эффекторную, центральную память и эффекторную память CD8 + субпопуляций Т-клеток (He et al. ., 2016; Родригес и др., 2017; Араки и др., 2009). В биологии рака ChIP-seq доказал свою эффективность для определения дифференциальных сигнатур энхансеров в опухолевых клетках (Akhtar-Zaidi et al., 2012). Независимый от мутаций эпигенетический контроль опухолевых супрессоров посредством триметилирования гистона h4 по лизину 4 (h4K4me3) был обнаружен с использованием подходов ChIP-seq (Chen et al., 2015b). Точно так же ChIP-seq выявила паттерны инвазии промоторов и энхансеров Myc, чтобы управлять широко распространенным биогенезом РНК как в опухолях, так и в иммунных клетках (Sabò et al., 2014; Lin et al., 2012; Nie et al., 2012).

В дополнение к подходам, которые оценивают ацетилирование, метилирование и связывание белков с различными локусами в геноме, недавно были разработаны инструменты для исследования структуры генома более высокого порядка. Такие методы, как DNAse-seq и ATAC-seq (анализ доступного для транспозаз хроматина), могут идентифицировать области открытого и закрытого хроматина (т.е. доступность хроматина) по всему геному (Buenrostro et al., 2013; Boyle et al., 2008; Thurman et al. al., 2012). Эти подходы используют ферменты для расщепления участков ДНК, которые не плотно обернуты вокруг нуклеосом, предположительно из-за активной транскрипции или их занятости ДНК-связывающими белками (например, факторами транскрипции). Они также позволяют отслеживать следы факторов транскрипции для идентификации сайтов связывания факторов транскрипции. Кроме того, комбинируя эти методы с вычислительными подходами, можно проанализировать влияние регулирующих элементов цис и транс на функцию гена.Модифицированная версия этих методов может одновременно активировать Bisulfite-seq на одном и том же образце (метил-ATAC-seq) (Spektor et al., 2019). Анализ доступности хроматина позволил охарактеризовать и определить функциональные последствия таких изменений для ряда видов рака (Corces et al., 2018; Denny et al., 2016), лейкоцитов (Buenrostro et al., 2018; Shih et al. ., 2016; Scharer et al., 2017; Sen et al., 2016) и исследованиях иммунологии опухолей (Satpathy et al., 2019; Corces et al., 2016; Филип и др., 2017; Benci et al., 2016). Такие подходы показали, насколько широко распространенное увеличение доступности хроматина позволяет транскрипционным программам, которые управляют прогрессированием опухоли и метастазированием (Denny et al., 2016). Другие исследования показали, что дисфункциональные опухолеспецифические Т-клетки CD8 + входят в одно из двух различных состояний хроматина, которые определяют, можно ли их перепрограммировать (Philip et al., 2017).

В то время как области открытого хроматина обнаруживают доказательства регуляции транскрипции, структуры хроматина более высокого порядка также играют критическую роль в контроле экспрессии генов.Дистальные элементы дальнего действия, такие как энхансеры, влияют на экспрессию генов даже на расстояниях более 1 мб в линейном пространстве генома (Lettice et al., 2003; Bulger and Groudine, 2011; Dekker, 2008). Чтобы оценить, как трехмерные конформации влияют на регуляцию, были разработаны различные технологии, которые способны запрашивать хромосомные взаимодействия на уровне генома (Davies et al., 2017). К ним относятся производные захвата конформации хромосомы (3C) (Dekker et al., 2002), такие как захват конформации кольцевой хромосомы (4C) (Zhao et al., 2006; Simonis et al., 2006), хромосомная конформационная копия углеродной копии (5C) (Dostie et al., 2006), NG Capture-C (Hughes et al., 2014; Davies et al., 2016), Hi-C (Lieberman -Aiden et al., 2009), а также методы, сочетающие 3C с ChIP, такие как анализ взаимодействия хроматина с помощью секвенирования парных концевых меток (ChIA-PET) (Fullwood et al., 2009) и HiChIP (Mumbach et al., 2016; Мумбах и др., 2017). Эти методологии 3C представляют собой варианты протоколов, в которых ДНК сшивается, расщепляется эндонуклеазами рестрикции, лигируется и амплифицируется с помощью ПЦР для идентификации областей в непосредственной близости.В частности, Hi-C позволил картировать все взаимодействия в геноме с разрешением в несколько тысяч оснований (Rao et al., 2014). Эти методы используются во многих исследованиях как в биологии опухолей, так и в иммунологии. Более ранние исследования с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и 3C первоначально предполагали, что межхромосомные взаимодействия между промоторами и энхансерами на разных хромосомах могут управлять развитием иммунных клеток (Hewitt et al., 2008; Ling et al., 2006), но впоследствии с высоким разрешением Полногеномные исследования с использованием Hi-C не подтвердили существование таких взаимодействий (Johanson et al.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *